pH/温度响应型聚合物PMAA-b-PDMAEMA的合成、性能调控及应用

孙月，王斯佳，吴明侠，宋先雨，徐首红

（1河南中医药大学药学院，河南 郑州 450000；2重庆三峡学院环境与化学工程学院，重庆 404020；3华东理工大学化学与分子工程学院，上海 200237）

环境响应型聚合物是一类拥有独特官能团或结构特征，能够依据外界环境微小变化诱导自身物理/化学性质发生突变的一类聚合物[1-2]。这些聚合物能对温度[3-5]、pH[6-8]、氧化还原[9-10]、酶[11-12]、光[13]及离子强度[14-15]等不同环境变化作出响应。由于这一特殊性质，近年来环境响应型聚合物得到广泛研究，可制造出应用于多种环境的智能材料，所制备的聚合物材料具有生物相容性好、可调控、合成成本低、制备简单等优点，成为在生物医药[16-17]、治疗检测、抗菌涂层[18]等领域研究的热点。

两种或多种聚合物基于共价或非共价键的相互作用可形成聚合物复合物，通过将带电基团与之相反的两种或多种聚合物进行共聚，可制备出结构更易调控、响应性更好的聚合物复合材料。聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯（PDMAEMA）是一种拥有pH和温度双重响应性能的聚合物[19-21]，具有可调控的相转变温度，聚合物的分子量、溶液pH、浓度等均会对温敏性产生影响[22-23]，可通过控制条件来调节合适的相变温度以应用于不同领域。聚甲基丙烯酸（PMAA）是具有pH响应性能的聚合物，拥有可调节的等电点，许多研究者们将PMAA与其他材料相结合，制备出具有特殊性质的功能材料。Wang等[24]通过将PMAA偶联到多肽上设计出一种具有潜在抗肿瘤性能的多肽-聚合物共轭物（PEPc-PMAA），研究了其与模拟细胞之间的相互作用，该共轭物在pH=5.5时引起膜结构改变，膜内物质大量泄漏。单一刺激响应型聚合物虽具备响应性能，但响应环境的灵敏度低，应用范围受限。近年研究者们[25-26]通过分子设计将多个刺激响应基团或聚合物链段引入嵌段共聚物中，以实现多种响应行为的协同作用。PDMAEMA 和PMAA 链段的侧基分别含有氨基和羧基基团，将两个具有单一功能基团的链段通过活性聚合法共聚，可制备出拥有多功能基团的双重或多重智能型聚合物，该类聚合物对环境的微小变化有更高的响应性，更灵敏的结构可调控性，通过结构间亲-疏水性的转换可实现在不同领域的应用。其中，该聚合物通过响应环境的变化拥有与抗菌肽类似的两亲性结构特征，可用于模拟抗菌肽的抗肿瘤作用机制；最重要的是，响应型聚合物拥有可自动识别周围环境变化的特殊性质，能选择性地靶向至肿瘤区域，通过肿瘤区域特殊的环境刺激实现对肿瘤细胞膜结构的破坏，从而导致细胞死亡。

本文制备了一系列具有pH/温度双重响应性能的共聚物PMAA-b-PDMAEMA，测试了共聚物在不同条件影响下的响应行为（图1），明确了其嵌段比、分子量及溶液pH对响应行为的调控，并利用共聚物在不同pH条件下的带电性能及亲-疏水性之间的转换，研究了对模拟肿瘤细胞膜结构的靶向破坏性，PMAA-b-PDMAEMA 展现出良好的功能可调控性，旨在为响应性共聚物的进一步开发应用提供参考。

图1 共聚物PMAA-b-PDMAEMA的pH/温度响应性示意图

1 实验

1.1 实验试剂

甲基丙烯酸叔丁酯（tBMA，>98.0%）、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DMAEMA，99.9%），TCL 科技集团股份有限公司，通过碱性氧化铝层析柱去除阻聚剂；溴化亚铜（CuBr，99.0%）、2-溴异丁酸乙酯（EBIB，98%），Sigma-Aldrich 有限公司，经冰乙酸、乙醇洗涤三次后真空干燥；N,N,N',N'',N'''-五甲基二乙烯基三胺（PMDETA，98%），上海麦克林生化科技有限公司；二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC，>98.0%）和二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG，>98.0%），艾伟拓（上海）医药科技有限公司；罗丹明6G，阿拉丁生化科技股份有限公司；葡聚糖凝胶G50，上海易恩化学技术有限公司；甲苯、二氯甲烷、1，4-二氧六环、浓盐酸，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 均聚物PDMAEMA、PtBMA和PMAA的合成

1.2.1 均聚物PDMAEMA的合成

本实验均采用原子转移自由基聚合（ATRP）法合成聚合物，将一定比例的单体DMAEMA、溶剂乙酸乙酯、配体PMDETA 和引发剂2-溴异丁酸乙酯依次加入三口烧瓶中，搅拌使之完全溶解。然后将该体系用液氮冷冻-抽真空-通氮气解冻循环操作3次，之后再次将体系冷冻，在氮气保护下加入催化剂CuBr，封口停止通氮气，数分钟后，再次抽真空通氮气解冻，保证体系处在无水无氧条件下；最后在70℃条件下反应24h。各物质的投料[DMAEMA]∶[EBIB]∶[PMDETA]∶[CuBr]摩尔比为a∶1∶2∶1，其中，a为DMAEMA 的投料量。待反应结束后，将反应溶液用少量乙酸乙酯稀释后通过中性氧化铝层析柱除去该体系中的CuBr/PMDETA 催化体系，旋蒸浓缩后，用10 倍体积的冰正己烷沉降纯化样品3次，室温下真空干燥至恒重，得到固体样品PDMAEMA。

1.2.2 均聚物PtBMA的合成

将一定比例的单体tBMA、溶剂甲苯、配体PMDETA 和引发剂2-溴异丁酸乙酯依次加入三口烧瓶中搅拌使之完全溶解。按照1.2.1节中ATRP法进 行 操 作。 各 物 质 的 投 料[tBMA]∶[EBIB]∶[PMDETA]∶[CuBr]的摩尔比为b∶1∶2∶1，其中，b为tBMA的投料量。待反应24h结束后，以二氯甲烷为洗脱液，将反应溶液通过中性氧化铝层析柱除去体系中的催化体系，经浓缩后用10 倍体积的冰甲醇沉降纯化样品3 次，室温下真空干燥至恒重，得到无色透明的黏稠状样品。

1.2.3 均聚物PMAA的合成

将一定量PtBMA 样品完全溶解于1,4-二氧六环中，按盐酸和1,4-二氧六环体积比为1/10的比例加入市售质量分数为36%～38%的浓盐酸，并置于80℃油浴中回流反应48h。反应结束后，静置分层，取下层溶液浓缩，于冰正己烷中沉降纯化样品3次，室温下真空干燥至恒重。将干燥后样品加水溶解并透析至溶液呈中性，冷冻干燥后密封保存，得到固体样品PMAA。

1.3 共聚物PMAA-b-PDMAEMA的合成

1.3.1 PtBMA-Br大分子引发剂的合成

在1.2.2 节中已合成PtBMA 大分子引发剂，此处不在赘述。采用1H 核磁共振波谱（NMR）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）对其结构进行表征。

在创客空间开设必修课程中没有开设的课程，作为第二课堂课程学习。例如，开设C语言程序设计课。电气工程及自动化系建筑智能化工程技术专业未开设C语言程序设计课，但是污水水下打捞机器人项目组大多数学生有来自该专业， C语言是污水水下打捞机器人控制器开发的基础语言。创新创业必修课、专业课、第二课堂构成了整个创新创业课程体系。

1.3.2 共聚物PtBMA-b-PDMAEMA的合成

向三口烧瓶中依次加入大分子引发剂PtBMABr、 溶 剂 乙 酸 乙 酯、 单 体DMAEMA、 配 体PMDETA，搅拌使混合物完全溶解，继续采用ATRP 法进行合成。各物质的投料[PtBMA-Br]∶[DMAEMA]∶[PMDETA]∶[CuBr]摩尔比为c∶d∶2∶1，其中，c为PtBMA-Br的投料量，d为DMAEMA的投料量。待反应24h结束后，经过柱、浓缩、沉降及干燥后得到反应产物。采用1H NMR和FTIR对其结构进行表征。

1.3.3 共聚物PMAA-b-PDMAEMA的合成

将一定量PtBMA-b-PDMAEMA 样品溶于1,4-二氧六环中，按1.2.3 节中的水解方法进行操作，得到终产物PMAA-b-PDMAEMA。采用1H NMR 和FTIR对其结构进行表征。

共聚物PMAA-b-PDMAEMA的合成路线如图2所示。

图2 PMAA-b-PDMAEMA的合成路线

1.4 共聚物PMAA-b-PDMAEMA 的pH 响应性测试

称取适量共聚物PMAA-b-PDMAEMA 配制成1mg/mL 的水溶液，采用0.1mol/L HCl 和0.1mol/L NaOH调节溶液pH。25℃条件下，采用动态光散射（DLS，NanoBrook，90 plus PALS，美国布鲁克海文）测定不同pH条件下共聚物水溶液的zeta电位，并利用UV-Vis（SHIMADZU，UV-2600i，日本岛津）测定共聚物水溶液在500nm 处透射率随pH 的变化曲线。

1.5 共聚物PMAA-b-PDMAEMA 的温度响应性测试

配制浓度为1mg/mL 的PMAA-b-PDMAEMA 水溶液，利用紫外测定共聚物水溶液在不同温度下的透过率，同时测定pH=8.5、9.5、10.0 条件下，溶液透过率随温度的变化曲线。测试温度范围为25～70℃，升温速率1℃/min。

1.6 模拟细胞膜的制备及与共聚物PMAA-b-PDMAEMA的相互作用测试

将定量上述脂质体样品和共聚物置于截留量3500 的透析袋中，并将透析袋放入相应稀释倍数的pH 分别为7.4 和5.5 的Tris-HCl 缓冲溶液中，控温37℃，等时间间隔取定量透析液测其在发射波长范围内的最大荧光强度，定义为Ft。荧光分子的累积泄漏率计算公式为：Ft/F0×100%。

2 结果与讨论

2.1 结构表征

2.1.11H NMR

本文合成了4 种具有不同嵌段比的共聚物PMAA-b-PDMAEMA，利用1H NMR 表征了其结构，以PMAA50-b-PDMAEMA43为例进行描述，结果如图3所示。图3(a)为未纯化的PtBMA在CDCl3中的1H NMR 谱图。未纯化前含有未反应的单体tBMA、大分子引发剂PtBMA-Br和溶剂峰，化学位移7.18、5.30（峰a1、峰a2）处为未反应完全的单体上碳碳双键的氢质子吸收峰，化学位移2.36处为溶剂甲苯的吸收峰。δ1.03～1.13（峰a、峰c）处为引发剂2-溴异丁酸乙酯末端的甲基氢和共聚物侧链上的甲基氢，δ1.41（峰d）处为PtBMA中叔丁基的甲基氢[H，—C(CH3)3]，δ1.81（峰b）处为PtBMA主链上亚甲基氢吸收峰（H，—C—CH2—），以上结果证明已成功制备大分子引发剂PtBMA-Br。通过核磁中未反应完全的单体上的双键峰a1与PtBMA 中峰d的积分面积之比计算出tBMA的转化率为85%，进而计算出所合成的大分子引发剂的聚合度和分子量。该系列其他PtBMA的聚合度皆按此方法计算。其中，tBMA的转化率见式(1)。

图3 PtBMA、PtBMA-b-PDMAEMA和PMAA-b-PDMAEMA的1H NMR图

图3(b)中除了含有上述PtBMA 的吸收峰外，还包含了PDMAEMA 的各个峰。δ2.30（峰h）处为PDMAEMA 上叔胺基的甲基氢[H，—N(CH3)2]；δ2.59（峰g）、δ4.07（峰f）处分别为连接N 的亚甲基氢（H，—O—CH2—CH2—N—）和连接O 的亚甲基氢（H，—O—CH2—CH2—N—）；δ1.82～1.95（峰c）处为主链上亚甲基氢。由此确定已成功合成两嵌段共聚物PtBMA-b-PDMAEM。根据结果中PtBMA 的特征吸收峰与PDMAEMA 的特征吸收峰的积分面积之比计算出PDMAEMA 的聚合度。该系列其他共聚物及其相应参数如表1所示。

表1 不同方法测定的PMAA-b-PDMAEMA的等电点

图3(c)中PDMAEMA 的3个特征吸收峰（峰c、峰d、峰e）都存在，而在δ1.41处PtBMA上叔丁基的特征峰完全消失，表明PtBMA-b-PDMAEMA 已完全水解为PMAA-b-PDMAEMA。

2.1.2 FTIR

图4 为均聚物PtBMA 和共聚物PtBMA-b-PDMAEMA 和PMAA-b-PDMAEMA 的红外谱图。图中2978cm-1处为PtBMA和PDMAEMA上甲基质子吸收峰，2823cm-1、2773cm-1处为PDMAEMA 上叔胺基的甲基质子吸收峰，证明已成功合成PtBMA和PtBMA-b-PDMAEMA。3370cm-1处为水解后PMAA 上—OH 的质子吸收峰，且图中1394cm-1、1367cm-1处PtBMA 的两个特征吸收峰变成了单峰，证明PtBMA-b-PDMAEMA 已完全水解为PMAA-b-PDMAEMA。

图4 PtBMA、PtBMA-b-PDMAEMA和PMAA-b-PDMAEMA的红外谱图

综上，核磁和红外的谱图结果证明了已成功合成均聚物和嵌段共聚物。

2.2 共聚物PMAA-b-PDMAEMA的pH响应性

2.2.1 zeta电位法

采用zeta 电位法测定了4 种共聚物的等电点，研究了其pH响应性，结果如图5所示。首先测定了均聚物PMAA的等电点，对比图5(a)和(d)可以看出，PMAA的聚合度越大，等电点越低，这是因为较长的PMAA链含有更多的羧基基团，在酸性条件下能电离出更多的阴离子。对于共聚物PMAA-b-PDMAEMA，在酸性条件下，由于PDMAEMA 上叔胺基团的质子化，继而与PMAA上的羧酸根离子发生电中和，PMAA链段呈疏水的电中性状态，此时体系呈现出正电性；随着溶液pH 的增大，PDMAEMA 链段逐渐去质子化，PMAA 链段开始电离，负电荷逐渐增多，在达到某一点时，体系所带的正负电荷中和，zeta电位表现为0mV，此时溶液的pH 即为其等电点；继续增大溶液pH，由于PMAA段的电离，体系的净电荷整体由正值变为负值，体系呈现出电负性。对比图5(a)～(c)和图5(d)～(f)发现，在PMAA一端修饰PDMAEMA链段后，等电点整体会向碱性偏移，且偏移的大小会随着PDMAEMA 链段长度的增加而增加[30]。以上结果表明，本文中合成的4种共聚物均具有良好的pH响应性，且其等电点的大小可根据PDMAEMA嵌段的聚合度及PMAA/PDMAEMA两者的嵌段比来调节。

图5 均聚物PMAA和共聚物PMAA-b-PDMAEMA水溶液在不同pH条件下的zeta电位变化

2.2.2 浊度法

采用浊度法进一步验证了共聚物的pH响应性，结果如图6 所示。当pH

图6 不同嵌段比的PMAA-b-PDMAEMA水溶液在不同pH下的透过率曲线

2.3 共聚物PMAA-b-PDMAEMA的温度响应性

2.3.1 溶液pH对相转变温度的影响

共聚物的温敏性由PDMAEMA 嵌段决定，且PDMAEMA 具有pH/温度双重响应性。为了更好地了解共聚物的温敏性以及影响温敏性的因素，本文首先考察了PDMAEMA均聚物的温敏性能，结果如图7 所示。图7 中当pH=3.0 时（pHpKa时，PDMAEMA 的透过率在达到临界温度后会随着温度的不断升高而快速降低，溶液由澄清变浑浊，说明此时发生相变，这是由于在碱性介质中时，PDMAEMA上的叔胺基团去质子化呈中性状态，随着碱性增加，去质子化程度升高，氢键作用力减弱，疏水作用增强，出现LCST，展现出良好的温敏性。图7中展示了均聚物PDMAEMA的LCST与溶液pH的关系，即随着溶液pH的增加，LCST逐渐降低，说明溶液的pH对聚合物的温敏性有较大影响。以上结果证明，PDMAEMA具有良好的温度可控性。

图7 不同pH条件下PDMAEMA30的透过率随温度的变化曲线及溶液pH与LCST的关系

本文选择在等电点附近（pH=8.5、9.5）和远离等电点（pH=10.0）的pH 研究pH 对共聚物温敏性的影响，基于PDMAEMA在碱性条件下才展现出温敏性，因此选择等电点在碱性的PMAA50-b-PDMAEMA43和PMAA30-b-PDMAEMA22两种共聚物，研究其在不同pH 条件下透过率随温度的变化，结果如图8所示。共聚物的温敏性与其等电点密切相关，当溶液pH 在等电点附近时，共聚物溶液对温度表现出较强的敏感性，在较低温度下即可发生相变。但在等电点附近，两个共聚物在pH=9.5 时的LCST值均低于pH=8.5时的LCST值（表2），这主要取决于PDMAEMA嵌段。本节中已明确PDMAEMA的LCST 是随着碱性的增强而逐渐降低，所以pH=9.5 条件下的LCST 值均低于pH=8.5 条件下的LCST值。而在pH=10 条件下，由于溶液pH 远离共聚物的等电点，其温敏性变弱，在较高温度下才显现出相转变行为，呈现出较高的LCST 值，此时两种聚合物的LCST值远高于pH=9.5和pH=8.5时的LCST，这点与上述提到的PDMAEMA 均聚物的LCST 值随pH 增大而降低的性质不同。此外，对比均聚物和共聚物温敏性发现，PDMAEMA在修饰PMAA嵌段后，由于其等电点会向酸性偏移，所以在相同pH条件下，共聚物的LCST 值要低于PDMAEMA 均聚物的LCST值。聚合物通过调节pH可改变其相转变温度，说明共聚物同时受pH/温度双重调控，该结果体现了PMAA-b-PDMAEMA 良好的温度和pH 双重响应特性。

表2 不同pH条件下共聚物的LCST值 单位：℃

图8 不同pH条件下，共聚物PMAA-b-PDMAEMA的透过率随温度的变化

2.3.2 分子量对相转变温度的影响

大量研究证明，分子量的改变也可直接影响聚合物的相转变行为。为了更好地分析共聚物的温敏性，首先选择三个具有不同分子量的均聚物PDMAEMA进行研究。图9为pH=9.0条件下溶液透射率随温度的变化曲线。从图中可看出，聚合物的LCST值会随着其分子量的增加而降低。这是因为随着PDMAEMA分子量增大，链段上所带的叔胺基团数目增多，碱性条件下可去质子化形成疏水中性状态的氨基增多，疏水缔合强度增加，同时较长的链更易发生缠绕聚集，温敏性增强，LCST值降低。因此，通过调节分子量可获得具有特定LCST的聚合物。

图9 pH=9.0时不同聚合度的PDMAEMA的透射率随温度的变化

为了进一步研究共聚物的分子量对温敏性的调控作用，本文选取了PMAA30-b-PDMAEMA22和PMAA30-b-PDMAEMA6两个共聚物，测定了其在pH=10.0条件下的透射率随温度的变化曲线，结果如图10 所示。PMAA30-b-PDMAEMA22展现出良好的温敏性，在39℃时透射率开始下降，在68℃时透射率下降至28.5%；PMAA30-b-PDMAEMA6的透射率在48℃时开始有所下降，随着温度的不断升高，下降曲线较为平缓，68℃时透射率约为70%。此外， PMAA30-b-PDMAEMA22的LCST 值 远 小 于PMAA30-b-PDMAEMA6，这是因为PDMAEMA 嵌段越长，疏水作用越强，温敏性增强，LCST 值也越低。由于PMAA30-b-PDMAEMA6中对温度敏感的PDMAEMA 嵌段较短，可形成的疏水分子链较少，所以即使在68℃的高温下透射率仍然较高，这一点与上述PDMAEMA均聚物的温敏性随分子量变化的研究结果一致。

图10 pH=10.0条件下不同嵌段比的PMAA-b-PDMAEMA透射率随温度的变化

2.4 共聚物PMAA-b-PDMAEMA 与模拟细胞膜的相互作用

基于共聚物PMAA-b-PDMAEMA在酸性条件下的正电性及疏水性，结合肿瘤病变部位的偏酸性环境，本文选择PMAA30-b-PDMAEMA6作为研究对象，探究其作为抗肿瘤剂的功能。利用薄膜分散法制备了包载荧光分子罗丹明6G的DPPC和DPPG脂质体并分别模拟正常细胞膜及肿瘤细胞膜，通过测定共聚物PMAA30-b-PDMAEMA6与两种模拟细胞膜分别在pH=7.4 和pH=5.0 条件下相互作用时，罗丹明6G的泄漏情况，探究该共聚物响应pH条件下对模拟肿瘤细胞结构的破坏性，进而明确其抗肿瘤潜能。结果如图11(a)所示，对于呈现电中性的DPPC脂质体而言，无论是在pH=7.4生理条件下还是pH=5.5酸性条件下，共聚物与DPPC的静电相互作用均较弱，所以罗丹明6G泄漏率几乎相同且相对较少。对于模拟肿瘤细胞膜结构的DPPG 脂质体，在pH=5.5时，PMAA30-b-PDMAEMA6带正电且具备一定的疏水性，其通过静电吸附作用有效地靶向至DPPG脂质体表面，随后再通过疏水作用插入膜中，破坏脂质体膜结构，造成膜内包裹的罗丹明6G 分子泄漏，1h内即达到了约80%的泄漏率，4h内几乎达到平衡，最终泄漏率接近100%；而在pH=7.4时，共聚物带负电，与DPPG产生静电排斥作用，吸附到脂质体表面的共聚物较少，相互作用弱，最终的泄漏率较pH=5.5时低。

图11 pH=7.4及pH=5.5条件下PMAA-b-PDMAEMA诱导的脂质体中罗丹明6G的泄漏率(a)及作用机理(b)

基于上述研究结果，将共聚物对模拟细胞膜的作用机理总结如图11(b)所示，共聚物受周围环境的刺激，在人体正常生理条件下与模拟正常细胞膜结合能力较弱，细胞膜结构完整；当到达病变的肿瘤区弱酸性环境时，电荷反转，共聚物通过正电性和疏水性选择性结合并插入到肿瘤细胞内部，破坏膜结构，引起膜内基质快速大量泄漏。

3 结论

本文利用ATRP 法成功合成了一系列具有pH/温度双重响应性的两嵌段共聚物PMAA-b-PDMAEMA，共聚物的pH响应性可通过改变PMAA与PDMAEMA 的嵌段比来调控。温敏性受溶液pH和分子量的影响，在等电点附近其温敏性较强，且共聚物的LCST随着溶液pH的增加而逐渐增大；此外，共聚物的LCST 值会随着PDMAEMA 分子量的增加而降低。PMAA30-b-PDMAEMA6与模拟细胞膜的相互作用结果表明，共聚物能通过响应环境的变化靶向至模拟肿瘤细胞并实现对膜结构的破坏作用。综上，本文所制备的PMAA-b-PDMAEMA 展现出良好的pH/温度响应性能及功能可调控性，有望实现在生物医药上的应用。