酒杜仲质量标准的研究

李靖云 方 磊* 丁 野 罗 艳 孙 辉 裴珂晗

1.湖南省药品检验检测研究院，湖南 长沙 410001；2.湖南省药品质量评价工程技术研究中心，湖南 长沙 410001；3.株洲千金药业股份有限公司，湖南 株洲 412000

杜仲始载于《神农本草经》，被列为上品[1]。历代在使用本品时均强调炮制后入药。宋代以前多以切制生用为主，宋代以后多采用加辅料炮炙的方法，有姜汁炒、盐水炒、酒炒、糯米炒、蜜炙等，其炮制程度各不相同，但去丝或断丝是一致的。酒炙始载于宋《全生指迷方》“去粗皮，捣烂，酒拌，炒乾”。此后，宋代的《女科百问》《济生方》及金元3部、明代6部、清代11部医药文献中有记载，方法基本为“酒浸，炒断丝”。

目前，《中国药典》2020版一部收载了中药材和饮片的杜仲及盐杜仲，但未收载酒杜仲[2]。同时，相应的部颁标准和各省中药饮片炮制规范也均未收载该品种。酒杜仲质量控制缺乏有效鉴别手段和必要的检查项目，对酒杜仲的药材质量难以保障，影响用药安全和临床疗效。

本研究通过收集湖南省内4家饮片生产企业的13批酒杜仲样品及其炮制方法，照《中国药典》2020版一部“杜仲”的质量标准，以外观性状、显微鉴别、水分、总灰分、浸出物及含量测定作为酒杜仲的质量控制指标，建立酒杜仲的质量标准，保障其用药安全，为中药饮片市场监管提供技术支持。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Nikon50i(日本尼康株式会社)；Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，色谱柱为 Capcell Pak-ADME C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；METTLER AE240型电子分析天平(瑞士梅特勒公司)；METTLER TOLEDO XSE 205DU(瑞士梅特勒公司)；BINDERFP115型强制对流干燥箱(德国BINDER GmbH)。

1.2 试剂 甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(色谱纯，霍尼韦尔贸易有限公司)，水为超纯水；对照品：松脂醇二葡萄糖苷(批号：111537-201706；纯度：91.7%，供含量测定用)由中国药品生物制品检定所提供。

实验所需的酒杜仲由湖南4家生产企业提供，及2批杜仲药材。样品详细信息见表1。

表1 样品信息表

表2 酒杜仲对应药材信息表

2 方法与结果

2.1 性状 按《中国药典》2020年四部通则0212药材和饮片检定通则项下药材的性状观察方法。对4家生产企业的13批酒杜仲进行观察，将其【性状】拟定为“本品呈小方块状。外表面淡棕色或灰褐色，稍光滑，有的树皮较薄，未去粗皮，可见明显的皮孔。内表面棕褐色或黑褐色，光滑。质脆，易折断，折断时胶丝弹性较差。略有酒香气，久置后气微，味稍苦。”实物如图1所示，具体性状特征点见表3。

A.企业A；B.企业B；C.企业C；D.企业D图1 酒杜仲性状图

表3 酒杜仲性状特征点

2.2 显微鉴别 按《中国药典》2020年四部通则2001显微鉴别法进行实验。结果13批次样品均能观察到木栓细胞、石细胞、橡胶丝等杜仲的显微特征(如图2所示)。拟定酒杜仲的显微鉴别为“本品粉末棕色。橡胶丝成条或扭曲成团，表面显颗粒性。石细胞甚多，大多成群，类长方形、类圆形、长条形或形状不规则，长约至 180 μm，直径 20～80 μm，壁厚，有的胞腔内含橡胶团块。木栓细胞表面观多角形，直径 15～40 μm，壁不均匀增厚，木化，有细小纹孔，侧面观长方形，壁三面增厚，一面薄，孔沟明显”。显微图如图2所示。

图2 酒杜仲的显微鉴别图

2.3 检查

2.3.1 水分 按《中国药典》2020年版四部通则0832水分测定法第二法烘干法进行测定。测定13批酒杜仲的水分，最低值为2.29%，最高值为8.95%，平均值为4.54%。结果见表4。

2.3.2 总灰分 按《中国药典》2020年版四部通则2302灰分测定法，测定13批酒杜仲的总灰分，最低值为4.66%，最高值为6.17%，平均值为5.58%。同时测定2批药材中的总灰分，计算相应酒杜仲饮片的总灰分转移率。结果见表5，两个生产企业7批次样品的平均转移率为120.29%。

表4 检查和浸出物测定结果

表5 酒杜仲对应药材总灰分结果

2.4 浸出物 按《中国药典》2020年版四部通则2201浸出物测定法水溶性浸出物热浸法进行测定。13批酒杜仲的浸出物，最低值为14.38%，最高值为17.29%，平均值为15.67%。测定2批药材中的水溶性浸出物，计算相应酒杜仲饮片的浸出物转移率。结果见表6，两个企业7批次样品的平均转移率为90.43%。

表6 酒杜仲对应药材浸出物结果

2.5 含量测定

2.5.1 色谱条件 色谱柱为 Capcell Pak-ADME C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流动相：甲醇-水(25∶75)；检测波长：277 nm；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 μL。

2.5.2 溶液的制备 对照品溶液：精密称取松脂醇二葡萄糖苷对照品13.13 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液①(0.4816 mg/mL)。精密称取松脂醇二葡萄糖苷对照品9.08 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液②(0.8326 mg/mL)。精密吸取对照品储备液，加甲醇依次稀释成浓度为0.1665 mg/mL、0.0333 mg/mL的对照品溶液。精密称取松脂醇二葡萄糖苷对照品5.90 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品液③(0.5410 mg/mL)。供试品溶液：取本品，剪成碎片，揉成絮状，取约2 g，精密称定，置索氏提取器中，加入三氯甲烷适量，加热回流6 h，弃去三氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷，再置索氏提取器中，加入甲醇适量，加热回流6 h，提取液回收甲醇至适量，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对照品溶液和供试品溶液色谱图如图3所示。

图3 对照品、供试品溶液色谱图重叠图

2.5.3 线性关系 分别精密吸取浓度为0.8326 mg/mL、0.1665 mg/mL、0.0333 mg/mL的对照品溶液5 μL、10 μL，注入液相色谱仪，测定，以峰面积积分值为纵坐标，进样量为(ng)为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程为：y=516.63X+8547.8，R2=1。结果表明：松脂醇二葡萄糖苷对照品在166.53～8326.36 ng范围内线性关系良好。如图4所示。

2.5.4 精密度试验 取同一份酒杜仲供试品溶液(批号19090305-1)，连续进样6次，每次10μL，按“2.5.1”项下色谱条件进行测定，计算RSD(n=6)为0.63%，表明仪器精密度良好。

2.5.5 稳定性试验 取同一份酒杜仲供试品溶液(批号19090305-1)，分别于配制后的0 h、3.5 h、9.5 h、13.5 h、25 h，精密吸取10μL，按“2.5.1”项下色谱条件进行测定，结果RSD为1.93%，表明供试品在25 h内稳定性良好。

2.5.6 重复性试验 取同一批酒杜仲供试品溶液(批号19090305-1)，依“2.5.2”项下方法制成6份供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进行测定，结果供试品RSD%为3.69，表明重现性良好。

2.5.7 回收率试验 取同一批次酒杜仲供试品溶液(批号19090305-1)，约1.0 g(6份)，精密称定，精密加入松脂醇二葡萄糖苷对照品溶液①适量，依“2.5.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进行测定，计算，结果平均加样回收率为96.75%。结果见表7。

表7 加样回收率试验结果 (n=6)

2.5.8 样品含量测定 对13批酒杜仲依“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进行测定。结果见表8。

表8 样品含量测定结果 (n=13)

3 讨论

性状和显微特征是中药材鉴定的传统方法，是检验中药材和饮片来源的正确性的重要手段[3]。性状项主要描述药材的形状、大小、表面(色泽、特征)、质地、断面、气味等特征[4]。酒杜仲在炮制后内表面颜色较炮制前变深，橡胶丝弹性较差，出现断丝。显微鉴别对于性状特征不明显、易混中药材和饮片，对其真伪的判断起到重要作用。酒杜仲的显微特征与杜仲的显微特征相比，并未因炮制出现明显改变。

中药中含水量与霉变、虫害、潮解、软化、质变等都有关[5-6]，总灰分与加工、运输、储存中药是否收到污染或掺杂有关，浸出物对于药材的活性成分或指标性成分不清或含量很低或尚无精确的定量方法时，可作为衡量指标[7]，因此，对于经过炮制的酒杜仲，分别对以上指标进行考察，并建议列入质量标准。对于浸出物的考察，虽然《中国药典》2020年版一部杜仲浸出物为醇溶性浸出物，但是考虑酒杜仲入药多为汤剂，所以，采用水溶性浸出物进行考察更具有参考意义。

杜仲中含有环烯醚萜类成分京尼平苷酸、京尼平苷，苯丙素类成分绿原酸，和木质素类化合物松脂醇二葡萄糖苷。经查阅相关文献，《中国药典》2020年版一部杜仲及盐杜仲项下，以及《香港中药材标准》《欧洲药典》《英国药典》收录的杜仲的现行标准均选择松脂醇二葡萄糖苷为指标性成分，采用高效液相色谱法(HPLC)进行含量测定[8]，同时，相对于京尼平苷酸、京尼平苷和绿原酸，松脂醇二葡萄糖苷含量相对较稳定，也更具有特征性[9]，因此，酒杜仲也选择了松脂醇二葡萄糖苷作为含量测定指标成分。

在含量测定研究时，由于酒杜仲呈坚硬的小方块状，保留了其树皮的特征，因此，需要将其剪碎，揉成絮状，以便于充分提取指标成分。酒杜仲中含有较多脂溶性杂质，易对检测产生干扰，采用三氯甲烷提取并弃去提取液的方式可以排除干扰。对比超声、回流及索氏提取3种方法，发现索氏提取的结果较超声和回流更稳定，并且易于完全提取，因此，选择索氏提取作为最终的提取方法。

综上所述，通过对酒杜仲性状、显微特征、水分、总灰分和浸出物等检查项及松脂醇二葡萄糖苷含量测定方法的研究，建立了酒杜仲的质量标准，可为该炮制药材的质量控制提供依据。