兰坪虫草活性成分的研究进展

张 琼 杨玉贤 蔡 苇 董庭邦 谌立新 和顺琴*

1.云南医药健康职业学院，云南 昆明 650033；2.云南经济管理学院，云南 昆明 650033

兰坪虫草(Ophiocordycepslanpingensis)是中科院西双版纳热带植物园陈吉岳博士和杨大荣研究员近几年在对云南虫草属野生资源进行调查时，在云南省兰坪白族普米族自治县营盘镇采集到的虫草新种-线虫草属，经分子系统发育分析认为其为冬虫夏草的近缘种[1]，将其命名为兰坪虫草，该区域少数民族采摘野生兰坪虫草食用，具有治疗肾虚肝疾、预防眼病等功效。

图1 兰坪虫草

经研究[2-3]发现，兰坪虫草中的活性物质主要包括虫草多糖、核苷类、虫草酸、甾醇类等，其主要的化学成分种类、含量与冬虫夏草较为接近，部分成分含量明显高于冬虫夏草，如人工兰坪虫草中的多糖含量为冬虫夏草的1.5倍，杜亚茜[4]通过检测发现兰坪虫草经人工培养后核苷类成分高于野生冬虫夏草，很有潜力成为冬虫夏草的替代用品。大量研究数据[5-7]表明兰坪虫草具有多种药理作用，能够抗氧化、抗疲劳、增强免疫力、改善肺纤维化、抗肿瘤、治疗肾衰以及延缓衰老和镇痛作用等，药用和食用价值极高，具有研究和开发的潜在价值。近年来，越来越多的科研工作者对兰坪虫草展开了深入的研究，有关云南兰坪虫草的主要化学成分、含量及其药理作用研究不断有报道，而对于兰坪虫草研究成果、研究进展方面的综述文献目前还显见报道。据此，本文重点从兰坪虫草的主要化学成分及其药理活性方面展开综述，以期为云南兰坪虫草的深入开发、应用及研究提供依据及奠定一些基础。

1 化学成分

兰坪虫草的主要化学成分种类、含量与冬虫夏草较为接近，目前已知兰坪虫草中含有多糖类、核苷类、总黄酮、总皂苷和总三萜类、甾醇类、虫草酸、酸脂类等成分。具体详见表1。

表1 兰坪虫草主要化学成分及作用[2]

1.1 多糖类 多糖类是兰坪虫草中主要的活性成分之一，通过检测人工兰坪虫草中的多糖含量为冬虫夏草的1.5倍[3]。姜利[8]在研究兰坪虫草中性多糖减轻顺铂诱导的肾毒性实验中，用PDA培养基(1%～2%琼脂粉+2%葡糖糖+2%土豆粉)、固体培养基，培养得到兰坪虫草菌丝体，制得供试品兰坪虫草菌粉，再根据水提醇沉法从供试品中提取出兰坪虫草粗多糖，经过阴离子交换色谱柱处理后，用H2O及氯化钠溶液进行梯度洗脱，洗脱液处理后待测。用凝胶渗透色谱法(GPC)测得兰坪虫草中性多糖(neutral polysaccharide of O. lanpingensis，ONP)的MW(平均分子量)约为6.1×104Da(道尔顿)。用FT-IR(傅里叶变换红外光谱法)检测后，根据FT-IR光谱图中发现O-H、C-O、C=O键的特征吸收峰，得出兰坪虫草粗多糖是一种典型的碳水化合物。再用UPLC-MS对ONP中的单糖组分展开了分析，得出ONP中单糖主要由Glc(葡萄糖)、Ara(阿拉伯糖)、Man(甘露糖)、Cal(半乳糖)构成，单糖摩尔比为27.5∶31.1∶21.9∶19.5，这些单糖是兰坪虫草中性多糖的主要成分。

周树波[9]采用了与姜利相似的方法，优化了兰坪虫草的固体发酵培养基，在含美洲大镰粉的固体培养基上生长成熟，通过超声破碎，高温蒸煮，75%的乙醇沉淀，梯度洗脱(0 M-1 M NaCl)，从兰坪虫草菌粉中提取、分离和纯化得到多糖，主要收集兰坪虫草多糖A组分(component A of O. lanpingensis polysaccharides，OAP)，并且对获得的 OAP 进行了表征，包括 GPC，FT-IR和高效液相色谱法(HPLC)分析单糖组成。得出OAP由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、阿拉伯糖和这五种单糖组成，其摩尔比为0.23∶0.14∶0.38∶0.05∶0.20，分子量约为1.6×104Da。

柯迎妹[10]以蒸馏水为溶剂，采用超声、离心、水提醇沉等，从兰坪虫草中提取得到纯的ONP，GPC法测得ONP的MW为3.2×105Da，用GC-MS(气质联用法)分析ONP的单糖组分与含量(摩尔比%)，Man、Glc、Cal分别是13.38%、81.31%、5.31%，经过FT-IR光谱图分析后发现ONP是含有吡喃环和糖醛酸的酸性多糖。陈自宏[2]将兰坪虫草经过洁净处理后，通过设置对应的温度，干燥至恒重，为增强有效成分的提取，粉碎过六号筛得兰坪虫草供试品，并用硫酸-苯酚法、紫外分光光度计测定兰坪虫草样品中多糖的含量，最终测得多糖含量为23.00±4.84 mg/g。赵聃聃等[7]通过相同的方法，测定兰坪虫草居群菌丝体中多糖的含量，方法准确可靠。

1.2 核苷类 杜亚茜[4]通过检测发现兰坪虫草经人工培养后核苷类成分、含量明显高于野生冬虫夏草。陈自宏等[11]在研究兰坪虫草菌产腺苷的培养工艺中，选用样品是野生兰坪虫草及其无性型兰坪被毛孢菌，利用HPLC法测定兰坪虫草样品中核苷类的含量，包括：腺苷[12](结构如图2所示)、2’-脱氧腺苷、腺嘌呤、尿苷(结构如图3所示)、尿嘧啶、肌苷、鸟苷、胸苷和胞嘧啶。做标准曲线，得到回归方程，并对该含量测定方法进行稳定性、精密度、重复性实验及加标回收率实验，验证以上含量测定方法的准确性和可靠性。最终测得样品中9种核苷类成分的含量分别是(113.11±3.70)μg/g、(9.01±0.45)μg/g、(50.63±2.70)μg/g、(2.686.83±28.72)μg/g、(71.32±3.90)μg/g、(530.59±1.75)μg/g、(636.36±29.19)μg/g、(24.55±1.63)μg/g和(3.88±1.13)μg/g，其中可通过优化培养基配方、培养温度、培养时间使腺苷的含量提高。

图2 腺苷的结构式

1.3 总黄酮、总皂苷和总三萜 陈自宏等[2]用70%乙醇、乙酸乙酯溶剂从兰坪虫草样品中提取总黄酮、总皂苷、总三萜，利用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色体系测量从样品中提取的总皂苷和总三萜含量；利用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色体系测量从样品中提取的总黄酮含量。选择对应的总黄酮、总皂苷和总三萜标准品，通过做标准曲线，计算标准品的回归方程；并对含量测定方法进行稳定性、精密度、重复性实验及加标回收率的测定，验证以上含量测定方法的准确性和可靠性。最终测得样品中总黄酮、总皂苷和总三萜的含量分别是(10.18±0.95)mg/g、(39.61±1.75)mg/g、(53.23±1.74)mg/g。黄酮、皂苷和三萜都是从中药材中提取出来的，在医药保健中是重要的天然活性成分，均具有抗氧化、抗菌抑菌、抗肿瘤等作用。

1.4 其他有机化学成分 陈自宏等[13]对兰坪虫草各菌株的发酵液进行薄层色谱筛选，得到的优良菌株用各种柱层析方法进行次生代谢产物的分离提取，并用核磁共振氢谱、碳谱技术鉴定化学结构。最终从兰坪虫草中得到虫草素、甾醇类等，其中虫草素备受关注。随后陈自宏等[2]又从兰坪虫草中提取纯化出多种化合物，有β-谷甾醇、D-甘露醇(虫草酸)、脂肪酸、甘油酯、有机酸、乌苏酸等，实验中利用紫外分光光度计、高碘酸盐氧化法测定D-甘露醇的含量为(61.39±3.33)mg/g。其中β-谷甾醇是白色针状结晶，分子式是C29H50O，不溶于水，具有抗肿瘤、止咳化痰等作用[14]；乌苏酸是白色精细粉末，C30H48O3，不溶于水，属于三萜类化合物，具有抗癌、抗病毒等作用。

1.5 无机化学元素 经检测[15-16]虫草类药物中一般含有多种无机元素，如：Pb、Cd、Se、Cr、Ca、K、P、Li、Zn、Mn、Mg、Na、Cu、Fe、Hg等30多种元素。而云南兰坪虫草中的无机化学元素成分及含量还尚未见报道。

2 药理活性

2.1 对肝、肺纤维化的改善作用 柯迎妹[10]通过检测小鼠肝脏的形态(如图4所示)、肝指数和脾指数等，发现兰坪虫草多糖能够明显缓解小鼠肝纤维化症状。此外，兰坪虫草多糖能提高小鼠肝脏中GSH含量、SOD活力，降低小鼠血清中ALT、AST水平以及肝脏中HYP和MDA含量，表明云南兰坪虫草多糖对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化确实具有较好的改善作用[17]。

兰坪虫草多糖可显著减少免疫抑制小鼠脾脏组织红髓区域充血，改善碳粒廓清能力，提高巨噬细胞的吞噬功能，促使ConA诱导的T淋巴细胞增殖，说明云南兰坪虫草多糖具有增强小鼠免疫力的作用[18-19]。

A.空白组；B.模型组；C.兰坪虫草多糖低剂量组；D.兰坪虫草多糖中剂量组；E.兰坪虫草多糖高剂量组图4 兰坪虫草多糖对肝纤维化小鼠肝脏形态学影响示意图[10]

江敏[20]通过研究兰坪虫草多糖缓解博来霉素引起的小鼠肺纤维化，表明兰坪虫草多糖可以改善博来霉素引起的肺纤维化。通过对肺组织重要生理生化检测指标的检测，发现兰坪虫草多糖使肺组织形态有所改善、所测的肺系数降低，肺组织羟脯氨酸含量、病理学评分降低，明显改善肺部氧化应激状态[21]。

张艳艳[22]研究发现兰坪虫草菌粉及其提取物对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化有一定改善作用，通过检测对应的指标，发现博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化使小鼠的体重增加，SOD活性增加，MDA含量降低等；且兰坪虫草提取物的防治效果要明显优于兰坪虫草菌粉并具有剂量依赖性，其作用机制可能与调节氧化应激及免疫反应相关。

2.2 对肾衰竭的改善作用 急性肾功能衰竭是指各种病因引起的肾功能在短期内(数小时或数周)急剧进行性下降，导致体内氮质废物潴留而出现的临床综合征。近年来，急性肾衰竭在住院患者中的发病率和死亡率逐年提高。急性肾功能衰竭目前还缺乏特异有效的治疗手段，在西医、西药方面治疗效果不佳，且具有较大的毒副作用，中医药在治疗早、中期的慢性肾衰竭患者方面有一定的效果，基于中医药理论，采用中药进行此类疾病的防治研究具有重要意义[23]。

姜利[8]研究发现，从云南兰坪虫草中分离的中性多糖对顺铂诱导的急性肾损伤小鼠有一定的改善作用，通过数据观察得知，兰坪虫草中性多糖使BUN、血肌酐、钙、MDA的含量降低，磷的含量增加，使SOD、GSH-PX的含量增加等。

兰坪虫草菌粉及其高、中、低剂量的水提物对腺嘌呤造成的慢性肾衰竭小鼠均有一定的改善作用。兰坪虫草菌粉及其不同剂量的水提物使小鼠肾脏逐渐恢复红褐色；使血清中尿素氮、血肌酐、血磷、丙二醛的含量降低，血钙、谷胱甘肽的含量升高，超氧化物歧化酶活力增强[24]。

2.3 抗衰老作用研究 显示从虫草中分离的多糖对果蝇有一定的延缓衰老的作用，而且效果非常明显，抗衰老作用随着浓度的增加而提高[25]。此外，从兰坪被毛孢提取的粗多糖对果蝇的抗衰老作用明显。在培养果蝇的过程中加入不同浓度的兰坪被毛孢粗多糖，定时记录果蝇的存活数、死亡数，并计算果蝇成虫的平均寿命、最高寿命和半数死亡时间。结果显示兰坪被毛孢提取的粗多糖使雌雄果蝇的平均寿命增加，其中粗多糖浓度为0.2%的平均寿命最高；一定浓度的粗多糖对最高寿命有影响，不同粗多糖对雌雄果蝇的半数死亡时间影响差异较大，整体来看云南兰坪虫草粗多糖对果蝇有明显的延缓衰老的作用[26]。

2.4 抗疲劳与增强免疫力作用 疲劳是长时间工作、熬夜导致的一种现象，长时间疲劳会导致机体出现病理性现象，所以疲劳对身体的影响很大。免疫力的高低会影响身体健康，增强免疫力能阻挡病毒、异物等对身体的损伤，所以免疫力对身体健康至关重要。

孔娜等[5]通过对小鼠进行负重游泳试验，研究数据表明人工兰坪虫草提取物使小鼠的游泳时间增长；并测小鼠体内检测指标的变化情况，发现人工兰坪虫草提取物能使二乙酰肟法测得的血尿素氮含量降低；通过测量乳酸脱氢酶的活性发现人工兰坪虫草提取物使小鼠的耐受力增强等；综上指标显示人工兰坪虫草提取物对小鼠有一定的抗疲劳作用。此外，通过对小鼠脾脏组织的观察、脾脏指数与胸腺指数的测定、脾脏T细胞的增殖情况周期变化等，结果表明人工兰坪虫草提取物能增强小鼠的免疫力。

2.5 抗氧化作用 自由基来源于体内一些分子的自动氧化、酶促氧化以及药物作用等，如果不能及时排除，自由基过量将会作用于体内的蛋白质、脂肪酸、细胞膜、线粒体等，导致机体正常细胞或组织损伤，最终引发各种疾病，如癌症、老年痴呆、心脏病和肿瘤，通过添加自由基清除剂或者抗氧化剂可以减缓自由基给机体带来的危害，因此天然抗氧化剂的研究十分必要。赵聃聃[7]通过对兰坪虫草菌丝体抗氧化活性的研究表明，兰坪虫草菌丝体提取的多糖、黄酮均有一定的抗氧化活性，而且抗氧化活性均随着样品浓度的增加而增强，并且多数菌株多糖、黄酮抗氧化活性高于冬虫夏草的抗氧化活性。

2.6 镇痛作用 陈自宏等[27]通过采用小鼠醋酸扭体试验法，设立对照组，分别给实验组、对照组小鼠注射不同剂量的野生兰坪虫草混悬液(低剂量组、中剂量组)，兰坪被毛孢发酵培养物混悬液(低剂量组、中剂量组)，兰坪被毛孢发酵培养物不同提取部分(乙醇部分、乙酸乙酯部分、石油醚部分与水提部分)，观察现象记录小鼠的扭体次数，并计算镇痛率，分析镇痛率并与对照组对比得知，野生兰坪虫草和兰坪被毛孢发酵培养物及兰坪被毛孢发酵培养物不同提取部分均能明显减少醋酸所致的小鼠扭体次数，说明其具有较好的镇痛效果。

3 前景展望

兰坪虫草是近年来发现的虫草新种，与冬虫夏草同属，亲缘关系较近，其主要有效成分种类与冬虫夏草较相似，部分成分含量明显优于冬虫夏草，且易于人工培养，有潜力成为冬虫夏草的替代用品[28-29]，可缓解资源匮乏导致的药品短缺现象，具有非常重要的临床意义。兰坪虫草含有虫草多糖、核苷类、虫草酸、甾醇类等主要活性成分，其活性成分具有对肺纤维化的改善作用、对肾衰竭改善作用、抗衰老、抗疲劳与增强免疫力、抗氧化、镇痛等多种药理作用，具有良好的开发前景。本文对云南兰坪虫草的化学成分、药理活性等方面作一个较为系统的阐述，以期为兰坪虫草的深入研究奠定基础。再者，经查阅文献发现，科研工作者们对兰坪虫草中的主要有机活性成分、含量以及药理作用研究较多，而对于此药物中无机化学元素与药理作用的关联性分析目前还鲜见报道，可考虑对此方面内容展开研究。