南鹤虱水提物及乙醇提取物对小鼠皮肤刺激性的初步研究

赵思烨 叶明星 陈山珊 丘志龙 苟文韬 颜伟泓 张伟云，2*

1.厦门医学院药学系/厦门市中药生物工程重点实验室，福建 厦门 361023；2.福建医科大学药学院，福建 福州 350122

南鹤虱又称窃衣子、野萝卜子，是伞形科植物野胡萝卜(DaucuscarotaL.)的干燥成熟果实，在我国主要分布于江苏、湖北、陕西、河南等省[1]。南鹤虱性平，味苦，微毒性；其归脾、胃经；具有杀虫消积功效[2]，用于蛔虫、蛲虫、绦虫病等体内虫积病症的治疗[3]。《新修本草》中记载该药“主蛔、晓虫，为散”；《开宝本草》中记载该药 “虫心痛，以淡醋和半匕服”，功效皆为杀虫[4]。

南鹤虱的化学成分主要有挥发油、萜类、黄酮、甾体类等[5-9]。研究[10]表明，南鹤虱的挥发性成分对蚊幼虫具有很好的杀灭作用；南鹤虱的甲醇提取物、戊烷提取物有一定的抑菌、抗肿瘤作用[11-12]；南鹤虱中还存在具有改善认知功能障碍[13]、修复肝脏损伤[14]等作用的成分。目前已有学者尝试将南鹤虱用于治疗皮肤病[15]，且在现代研究中乙醇和水为最常用的提取溶剂[16]，水是强极性溶剂，南鹤虱中的亲水性成分都能被水溶出，乙醇是最常用的亲水性有机溶剂，乙醇的溶解范围广，故本实验采用水、乙醇分别对南鹤虱进行提取，为进一步验证其皮肤用药的安全性，故开展皮肤刺激性实验，皮肤刺激性实验能够反映受试物对皮肤是否存在刺激性，可用于初步评价受试物作用于皮肤的安全性。

实验以南鹤虱的水提物和乙醇提取物作为研究对象，分别对小鼠正常皮肤及划伤皮肤涂抹给药，通过观察小鼠的皮肤情况和计算皮肤刺激积分的平均分值，从而评价南鹤虱皮肤用药的安全性，为后续进一步研发南鹤虱的护肤产品提供一定的理论依据。

1 实验材料

1.1 实验药材 实验所用南鹤虱采自中国河南省，由厦门医学院药学系中药学专业的向云亚老师鉴定其为伞形科植物野胡萝卜(DaucuscarotaL.)的干熟成熟果实。

1.2 实验动物 健康SPF级ICR小鼠36只,雌雄各半,体重20～25 g,浙江省实验动物中心提供,生产许可证号:SCXK(浙)2019-0002,合格证编号:20210506Abzz0100000542(雌)、20210506Abzz0100000316(雄)。

1.3 仪器 脱毛膏(广州诺菲化妆品有限公司)、EYEL4旋转蒸发仪(上海爱朗仪器公司)。

2 实验方法

2.1 提取物的制备

2.1.1 南鹤虱水提物的制备 取河南产南鹤虱药材500 g，分为5份，每份分别与1000 mL的蒸馏水共同加入2000 mL圆底烧瓶中，浸泡1 h，电热套设定温度为150 ℃，将药材加热煎煮至沸腾，共煎3次，每次1 h，停止加热，将3次滤液合并。重复上述实验操作4次，合并滤液，浓缩，得到南鹤虱水提物(3.3 g生药/mL)，置于4 ℃冰箱暂存备用。

2.1.2 南鹤虱乙醇提取物的制备 取河南产南鹤虱药材500 g，分为5份，每份分别与1000 mL的75%乙醇溶液共同加入2000 mL圆底烧瓶中，电热套设定温度为85 ℃，回流提取3次，每次1 h，将三次滤液合并，重复上述实验操作4次，合并滤液，浓缩，得到南鹤虱乙醇提取物(3 g生药/mL)，置于4 ℃冰箱暂存备用。

2.2 一次给药皮肤刺激性实验 取SPF级ICR小鼠18只，雌雄各半，随机分为3组：空白对照组、一次给药水提物组和一次给药醇提物组，每组6只。随机分组后，使用脱毛膏去除小鼠背部脊柱两侧的毛发，脱毛范围为2 cm×3 cm，将小鼠右侧皮肤划伤为 “=”字形，以皮肤渗血为度[17]，分为左侧的正常皮肤区与右侧的划伤皮肤区。空白对照组两侧皮肤均涂纯水，水提物组、醇提物组于皮肤两侧分别涂抹南鹤虱水提物、乙醇提取物，涂抹面积均为2 cm×3 cm。给药后用纱布覆盖两侧的脱毛区域并用无刺激的医用胶布进行固定，24 h后拆除[18]，用蒸馏水清洗净小鼠两侧皮肤，在清洗后的1 h、24 h、48 h、72 h时刻分别观察涂抹部位是否出现红斑、水肿等现象，按皮肤刺激反应积分以及皮肤刺激强度评分标准进行评价。

2.3 连续多次给药皮肤刺激性实验 实验方法与一次给药皮肤刺激性实验相同，空白对照组每日于皮肤两侧涂抹纯水1次，涂抹面积为2 cm×3 cm，连续涂抹7 d；水提物组、醇提物组每日于皮肤两侧分别涂抹南鹤虱水提物、乙醇提取物1次，涂抹面积为2 cm×3 cm，连续涂抹、观察7 d；7 d后三组小鼠用蒸馏水擦洗净两侧皮肤后再观察7 d。每次在相同的时间内观察，连续观察14 d，按皮肤刺激反应积分以及皮肤刺激强度评分标准进行评价。

2.4 皮肤刺激评价标准 皮肤刺激反应的表现主要是观察皮肤是否有红斑，水肿的现象[19]。参考国家食品药品监督管理总局发布的《中华人民共和国国家标准化妆品安全性评价程序和方法》对皮肤红斑、水肿的现象进行分类，每一类对应一种积分[20]，见表1。皮肤刺激强度的评价：每只动物的平均分值=(红斑总分+水肿总分)/ 动物数量，得出的分值即为相应的皮肤刺激强度[20]，见表2。

表1 皮肤刺激反应评分标准[20]

表2 皮肤刺激强度评分标准[20]

3 结果

3.1 一次给药皮肤刺激性实验 一次给药后，经观察发现各组小鼠行为、活动均无异常，无死亡现象。空白对照组小鼠在各时刻两侧皮肤均正常，无红斑、水肿现象。一次给药水提物组中，在1 h时刻有小鼠左侧皮肤出现中度红斑，右侧皮肤出现中度水肿现象，在24 h、48 h、72 h时刻皮肤红斑、水肿现象逐渐消退，其余小鼠各时刻两侧皮肤均无红斑、水肿现象。一次给药醇提物组中，在24 h时刻有小鼠右侧皮肤出现轻度红斑现象，在48 h、72 h时刻皮肤红斑现象逐渐消退，其余小鼠各时刻两侧皮肤均无红斑、水肿现象。统计分析结果显示，与空白对照组相比较，南鹤虱水提物组、醇提物组两侧皮肤的皮肤反应积分均无显著性差异。各组皮肤反应积分值见表3，皮肤刺激强度评价见表4，小鼠皮肤反应代表性照片如图1。

表3 一次给药对小鼠皮肤刺激反应分值 (n=6)

表4 一次给药对小鼠皮肤刺激强度评分 (n=6)

图1 小鼠皮肤反应代表性照片

3.2 连续多次给药皮肤刺激性实验 多次给药后，经观察发现各组小鼠行为、活动均无异常，无死亡现象。空白对照组、多次给药水提物组及醇提物组小鼠两侧皮肤均正常，无红斑、水肿现象。各组小鼠的皮肤反应刺激强度得分均为0分，表明在连续多次给药实验中，南鹤虱的水提物及乙醇提取物对小鼠的正常皮肤和划伤皮肤均无刺激性。统计分析结果显示，与空白对照组相比较，南鹤虱水提物组、醇提物组两侧皮肤的皮肤反应积分均无显著性差异。

4 讨论

皮肤刺激性实验是指皮肤接触受试物后产生的局部可逆性损伤，包括一次给药皮肤刺激性实验和多次给药皮肤刺激性实验[20]，其典型表现是出现红斑或水肿现象。一次给药皮肤刺激性实验能够直接反映受试物对皮肤的刺激程度，多次给药皮肤刺激性实验则能够反映受试物对皮肤的刺激性以及受试物对皮肤长期的慢性积累刺激性[21]。

本实验参考国家食品药品监督管理总局发布的《中华人民共和国国家标准化妆品安全性评价程序和方法》，对南鹤虱的水提物及乙醇提取物作用皮肤的安全性进行研究。实验结果表明，一次给药皮肤刺激性实验中，南鹤虱水提物组、醇提物组各有1只小鼠皮肤出现红斑、水肿现象，其余小鼠皮肤均正常，按照皮肤刺激评价标准计算，小鼠的皮肤反应刺激强度得分均小于0.5分，以表4评价皮肤刺激强度，表明南鹤虱的水提物及乙醇提取物对小鼠正常皮肤和划伤皮肤均无明显刺激性。在连续多次给药皮肤刺激性实验中，各组小鼠均没有产生明显的刺激反应，小鼠皮肤均无红斑、水肿现象，小鼠正常皮肤及划伤皮肤的皮肤反应平均积分值均为0分，表明南鹤虱的水提物及乙醇提取物对小鼠正常皮肤和划伤皮肤均无刺激性。

综上所述，南鹤虱的水提物及乙醇提取物对正常皮肤和划伤皮肤的刺激性小，为前期课题组开展南鹤虱提取物驱蚊、护肤的相关研究提供了实验参考，也为探讨南鹤虱更广泛的用途提供一定的理论依据。但本实验仅在一种实验动物上进行研究，实验结果具有局限性，仍需在多种实验动物上进行研究相互验证，以获取更加准确的结果。