HPLC法测定蒙药材金露梅中没食子酸含量

郭凤英 闫凤杰 关金凤 莫日根高娃 于海云

通辽市市场检验检测中心，内蒙古 通辽 028000

金露梅(PotentillafruticosaL.)又名“金老梅”“药王茶”等，为蔷薇科委陵菜属落叶灌木，株高0.5～2 m，多分枝，羽状复叶，花瓣黄色[1]。全株可入药，具有清暑热、益脑清心、健胃消食及预防心脑血管疾病等药用功效[2]。没食子酸为金露梅中活性成分之一[3]，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等多种生物活性[4-11]。目前未见对金露梅中没食子酸含量测定的研究。本文以不同产地来源的金露梅为试验药材，建立其活性成分没食子酸的高效液相含量测定方法，同时比较了不同产地的含量差异，为金露梅在临床上的应用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 SHIMADZU LC-2030C 3D Plus 高效液相色谱仪(二极管阵列检测器，LabSolution 工作站)；Kromasil 100-5-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；MS105DU型电子天平；DZKW-S-6数显恒温水浴锅。

1.2 材料 没食子酸对照品(批号：110831-201906，含量91.5 %，中国食品药品检定研究院)；水为高纯水；甲醇为色谱纯，盐酸及磷酸均为优级纯。6批药材均为自采，经鉴定，均为金露梅(PotentillafruticosaL.)。样品来源见表1。

表1 药材来源表

2 方法与结果

《中华人民共和国药典》[12]所载药材余甘子、五倍子、委陵菜和地榆与金露梅含有相同的药效成分——没食子酸，故本研究以其含量测定项下的色谱条件作为参考，经反复对比试验，从理论塔板数，分离效果，拖尾因子及出锋时间等方面进行考察，最终采用以下色谱条件进行试验。

2.1 色谱条件 Kromasil 100-5-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相为甲醇-0.1 %磷酸(10∶90)；流速为1.0 mL/min；检测波长273 nm；柱温30 ℃；进样量为10 μL；记录时间为20 min；理论板数按没食子酸计算，不低于5000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备液的制备 精密称取没食子酸对照品(含量91.5%)0.01252 g，置10 mL量瓶中，加50 %甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1.146 mg/mL的没食子酸对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取金露梅供试品粉末(过四号筛)0.1 g，置250 mL锥形瓶中，精密加入4 mol/L盐酸溶液25 mL，称定重量，于水浴上加热回流60 min，冷却，称定重量，用4 moL/L盐酸补足减失重量，摇匀，滤过，续滤液过0.45 μm滤膜，即得。

2.3 线性关系考察 分别精密量取“2.2.1”项下的没食子酸对照品储备液30 μL、50 μL、100 μL、150 μL、300 μL、400 μL、500 μL、600 μL、1200 μL，置10 mL量瓶中，用4 mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，即得实际含没食子酸分别为3.44 μg/mL、5.73 μg/mL、11.46 μg/mL、17.19 μg/mL、34.38 μg/mL、45.84 μg/mL、57.30 μg/mL、68.78 μg/mL、137.52 μg/mL系列浓度的对照品溶液。精密量取上述系列溶液10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品浓度(μg/mL)为横坐标X，以对照品峰面积为纵坐标Y，做线性回归方程，得到Y=24561X-41022，r=1.000。表明没食子酸在3.44～137.52 μg/mL范围内呈良好的线性关系。如图1所示。

图1 没食子酸标准曲线图

2.4 精密度试验 精密称取内蒙古阿尔山Sample-2样品0.1013 g，按“2.2.2”项下的方法制成精密度试验溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，重复进样6次，测得峰面积的平均值为883641，RSD %为0.241 %，表明该方法的精密度良好。见表2。

表2 精密度测试结果表

2.5 稳定性试验 精密称取内蒙古阿尔山Sample-2样品0.1016 g，按“2.2.2”项下的方法制成稳定性试验溶液，精密吸取10 μL，分别于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h注入液相色谱仪，测定峰面积。结果显示24 h内峰面积RSD %为0.348 %，表明该方法提取的样品溶液在24 h内的稳定性良好。见表3。

表3 稳定性试验结果表

2.6 重复性试验 取约0.1 g内蒙古阿尔山Sample-2样品6份，精密称定，按“2.2.2”项下的方法制成重复性试验溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。依据2.3项中的线性回归方程计算6份样品中没食子酸含量，结果显示6份样品中没食子酸平均含量为9.261 mg/g，含量RSD %为0.675 %，表明该方法的重复性良好。见表4。

2.7 加标回收率试验 取已知含量内蒙古阿尔山Sample-2样品(平均含量9.261 mg/g)6份，各约0.05 g，精密称定，置250 mL锥形瓶中，分别精密加入没食子酸对照品储备液0.4 ml，按2.2.2项下的方法，制成加标回收溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。计算回收率，结果见表5，加标回收率平均值为99.4 %，RSD %为1.588 %。

表4 重复性试验结果表

表5 加标回收率试验结果表

2.8 不同产地样品含量测定 取表1中6批产地药材，按照2.2.2项下的方法，制成6批供试品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算每批样品中没食子酸含量，结果见表6。从表中数据可以看出，6批产地的金露梅中，没食子酸含量在3.156～11.537 mg/g之间，差异明显。其中图里河产地的含量约是蛮汉山产地的4倍。造成含量差别大的原因可能是生长环境不同，光照、土壤、水源及温湿度等条件的差异，影响了金露梅植株的生长和代谢过程。

表6 不同产地金露梅中没食子酸含量结果表

表6(续)

3 讨论

参照《中华人民共和国药典》2020年版一部“余甘子、五倍子、委陵菜和地榆”等药材含量测定项下没食子酸的测定方法[9]，以甲醇-0.1%磷酸(10∶90)为流动相，检测波长273 nm，此条件下没食子酸检测灵敏度高，其它组分对目标峰无干扰，保留时间适宜，理论塔板数较高。

药材粉末以4 moL/L盐酸为提取溶剂，采用加热回流方式提取，为保证没食子酸提取完全，考察了回流30 min、60 min和120 min的提取含量，结果在回流60 min时含量已达到最高，故提取时间定为60 min。

含量测定结果显示：6批产地金露梅中没食子酸含量差异明显，在3.156～11.537 mg/g之间。内蒙古图里河产地的金露梅中没食子酸含量最高，在金露梅选购和临床选用上可作为首选参考因素。

通过精密度、稳定性、重复性和加标回收率试验，结果表明该方法简便易行，准确可靠，可作为金露梅中没食子酸含量测定的方法。