甘草渣发酵产非淀粉多糖酶菌株筛选及产酶的动态变化

摘"要：【目的】""从4株真菌中筛选出产非淀粉多糖酶水平较强的菌株，为甘草渣固态发酵生产非淀粉多糖酶工艺奠定基础。

【方法】""设计刚果红法及滤纸条崩解试验，对4种真菌（黑曲霉、里氏木霉、黄孢原毛平革菌、康宁木霉）进行初筛，采用甘草渣摇瓶发酵进行复筛，测定纤维素酶（CMC酶、滤纸酶）及木聚糖酶活力。将产酶水平最高的菌株与甘草渣进行固态发酵，验证其产酶效果。

【结果】""4株真菌均具有产纤维素酶、木聚糖酶的能力。黑曲霉与其他3种菌株间存在拮抗作用。黄孢原毛平革菌和康宁木霉较其他2株真菌产纤维素酶较高，在发酵第4 d时CMC酶活力分别达到2.10、2.31 IU/mL。黑曲霉摇瓶复筛发酵产木聚糖酶活力最高可达97.46 IU/mL，而黄孢原毛平革菌与康宁木霉混菌发酵产木聚糖酶活力最高可达131.707 IU/mL。

【结论】""甘草渣与黄孢原毛平革菌、康宁木霉混合固态发酵生产出的非淀粉多糖酶活力增长周期更稳定，产量更高。甘草渣作为农业副产品有潜质成为未来生产酶的低成本底物。

关键词：""甘草渣；纤维素酶；木聚糖酶；固态发酵

中图分类号："S182""""文献标志码："A""""文章编号："1001-4330（2024）11-2733-09

0"引 言

【研究意义】截止2021年新疆甘草种植面积达2.6×104 hm2（40余万亩），年产100×104 t，其中70%以上分布在喀什地区、阿克苏地区和巴音郭楞蒙古自治州（简称巴州）等地（州）［1］。甘草渣是甘草酸提取后所剩余的固体废弃物，甘草渣中仍含有如黄酮类、多糖和甙类、氨基酸和酚类等10 余种药用成分，其对于促进动物育肥、提升免疫力具有潜在的效果，因此其具有转化为功能性饲料添加剂的潜力［2-3］。合理运用生物发酵技术对实现中药渣生态化再利用具有重要意义。【前人研究进展】甘草渣饲料化研究目前相对较少，已有的研究主要集中在甘草渣直接饲喂应用，虽然在一定程度上能提高动物生长性能等指标，但总体应用效果并不显著。吴华等［4］在肉鸡饲粮中添加 3%、4%、5%的甘草药渣可显著提高肉鸡的日增重，降低料肉比，并且能够提高肉鸡粗蛋白表观代谢率；发酵甘草渣及动物饲喂，主要利用乳酸菌、酵母菌、芽孢类菌种发酵提高粗蛋白，或者利用黑曲霉，白腐菌等发酵产酶。甘草渣经发酵后其细胞和纤维结构被破坏，活性物质更有利于溶出。吕丽静等［5］利用酿酒酵母菌与植物乳杆菌发酵甘草渣，发现发酵后药渣中总黄酮、甘草素及异甘草素等有效成分含量有所升高。非淀粉多糖酶包括纤维素酶、β-葡聚糖酶、果胶酶和木聚糖酶等，可以降解饲料中非淀粉多糖（NSP）的多聚体、使NSP的抗营养性降低，进而使饲料利用率提高［6］。曾飞等［7］利用从腐烂的甘草中分离的草酸青霉 G2菌，液体发酵甘草药渣可以产生活力较高的纤维素酶；李曼曼等［8］利用绿色木霉菌对丹皮提取残渣进行固态发酵产纤维素酶，且发酵后残渣可以直接进行糖化发酵。【本研究切入点】目前多数文献主要围绕农业生物质生产一种酶的研究，需通过筛选4株真菌筛选出甘草渣发酵生产多糖酶。【拟解决的关键问题】通过刚果红法及滤纸条崩解试验对4种真菌（黑曲霉、里氏木霉、黄孢原毛平革菌、康宁木霉）进行初筛，筛选出可高效利用甘草渣生产非淀粉多糖酶菌株并且分析其酶活动态变化规律，为甘草渣资源化再利用奠定理论基础。

1"材料与方法

1.1"材 料

1.1.1"甘 草

甘草渣来自新疆阿拉尔新农甘草产业有限责任公司，在实验室洗净烘干后经过粉碎过5目筛。其中有机质95.2%、氮含量0.67%、钾含量0.08%、磷含量0.447%、自然风干水分2.3%。麸皮购自新疆泰昆股份有限公司。

1.1.2"菌株

黑曲霉（HQ）、黄孢原毛平革菌（HB）、康宁木霉（KN）购自国家菌种保藏中心；里氏木霉（LS）由新疆农业科学院微生物应用研究所菌种保藏室提供。

1.1.3"培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA（g/L）：马铃薯浸粉6.0 、葡萄糖20.0 、琼脂20.0、pH （5.6±0.2）、水1 000 mL；

马铃薯葡萄糖水培养基PDB（g/L）：马铃薯浸粉6.0 、葡萄糖20.0 、pH （5.6±0.2）、水1 000 mL；

纤维素酶初筛培养基（g/L）：（NH4）2SO42.0，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4 1.0，NaCl 0.5，CMC-Na 2.0，刚果红0.2，琼脂20.0，蒸馏水1 000 mL，pH 自然。

木聚糖酶初筛培养基（g/L）：木聚糖10.0，蛋白胨1.0，KH2PO41.0，（NH4）2SO4 4.0，MgSO4·7H2O 0.5，琼脂20.0，刚果红0.2，蒸馏水1 000 mL。

滤纸条崩解培养基（g/L）：（NH4）2SO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4 1.0，酵母粉0.1 蒸馏水1 000 mL，滤纸条（1 cm×6 cm）3条/三角瓶。

药渣培养基（g/L）：中药渣20、NaCl 5.0、（NH4）2SO4 "3.0、MgSO4·7H2O "3.0、去离子水1 000 mL、pH自然，120℃灭菌20 min。

固态发酵产酶培养基（g/L）：甘草渣15.0、麸皮15.0、K2HPO4 0.5、料水比1∶"0.8。

1.2"方 法

1.2.1"菌种生长曲线

菌株连续活化3次后按一定量接种于PDB培养基中，每12 h取样后8 000 r/min离心5 min，然后105℃烘干至恒重后称重，每次3个平行，以培养时间为X轴、菌体干重为Y轴，绘制生长曲线［9］。

1.2.2"菌种产纤维素酶、木聚糖酶初筛

用10 mm打孔器在长满菌丝体的平板上取下两块菌饼，拿无菌镊子接在羧甲基纤维素钠刚果红平板及初筛木聚糖酶培养基上，在28℃下培养至3～5 d观察透明圈出现情况，分别测量透明圈直径D（cm）和菌体直径d（cm）大小，并计算透明圈与菌体直径的比值D/d。计算酶的相对比活力（A），A=透明圈的直径/天数（4 d）。

1.2.3"滤纸条崩解试验及失重率测定

将无菌的滤纸条烘干，装入高温灭菌后的滤纸条培养基中，接入一定量的菌液，在28℃，180 r/min下培养，每天观察滤纸条的变化，并于第7 d记录最终降解状态。

滤纸条失重率测定［10］：培养7 d 后，在4 000 r/min离心10 min，倒掉上清液，洗掉滤纸上的菌体，反复冲洗，105℃烘干称重。

X="m-m0"m".

式中，m：接种前滤纸质量（g），m0：接种后滤纸质量（g）。

1.2.4"菌种间对峙试验

将活化后的各供试菌种取菌饼两两组合进行平皿培养，倒置于28℃恒温培养箱中培养至菌丝基本铺满皿底，观察菌丝接触区有无对峙反应［11］。

1.2.5"菌种的复筛

将菌株平板活化至三代，待其长满整个平板后，用打孔器取3个菌饼（10 mm）接种至药渣培养基（100 mL/250 mL）中进行酶活测定，28℃、 180 r/min 恒温培养，每天测定其产酶动态变化。

1.2.6"固态发酵甘草渣产酶

固态发酵：将筛选出的菌种按10%接种量接种于固态发酵产酶培养基中，28℃下静置培养一段时间，每24 h翻曲1次。连续观察并记录1周培养基产酶形态变化。

粗酶液的制备：发酵结束后，瓶内均匀3点各取样1 g，用10倍的蒸馏水稀释，在8 000 r/min，4℃ 离心5 min后取上清液即为粗酶液。

产酶：发酵产物中纤维素酶活［12］、木聚糖酶活［13］测定方法。

1.3"数据处理

采用 Excel 2019软件整理归纳及Origin 2021制图，采用 SPSS20.0 进行统计软件进行单因素方差分析，数据进行 3 次重复试验，结果以“平均值±标准差（X±SD）”表示。

2"结果与分析

2.1"生长曲线的绘制

研究表明，LS、HB、KN在 20～72 h期间干重持续上升，生长速度较快，为菌株对数生长期；72～84 h菌株干重基本无变化，进入生长平稳期。HQ在12～60 h干重上升较快，为菌株对数生长期；60～84 h干重基本无变化，进入生长平稳期。图1

2.2"菌种产纤维素酶初筛

研究表明，KN的透明圈直径最大为3.00 cm，HQ的菌落直径最大为1.67 cm，而KN的透明圈直径与菌落直径比值最大为2.286；各菌株的纤维素酶的相对比活力分别为0.606、0.762、0.599和0.564，其中KN的纤维素酶的相对比活力最大。表1

2.3"滤纸条崩解试验及失重率变化

研究表明，KN、HB降解滤纸条程度较完全，滤纸条从长方形降解成短状碎圆片；HQ也同样将滤纸条分解成碎纸片但破碎程度较弱；LS降解纸条边缘弯曲且有少絮状物。KN、HB两株菌株降解滤纸条后滤纸的失重率显著远高于另外2株菌，其失重率分别为43.37%、47.35%。KN、HB具有较好的纤维素降解能力。图2～3

2.4"菌种产木聚糖酶初筛

研究表明，KN的透明圈直径最大为6.1 cm，LS的菌落直径最大为1.85 cm，而HQ的透明圈直径与菌落直径比值最大为4.029；各菌株的木聚糖酶的相对比活力分别为0.643、0.945、1.007和0.555，其中HQ产木聚糖酶的相对比活力最大。表2"

2.5"菌种间对峙试验

研究表明，KN、HB和LS之间可以很好的相融合不存在拮抗作用，而HQ与KN、HB和LS之间均产生拮抗，其中与LS的拮抗反应最为强烈。图4

2.6"4株真菌产非淀粉多糖酶比较

2.6.1"葡萄糖和木糖标准曲线

研究表明，葡萄糖标准曲线方程为 Y = 0.003 5X - 0.018，R2 为 0.999 7；木糖标准曲线方程为 Y = 0.710 5X + 0.010 2，R2 = 0.999 6。R2值表征适合用于葡萄糖、木糖含量的测定。图5

2.6.2"菌株摇瓶复筛产纤维素酶

研究表明，4株真菌单独发酵，在发酵第4 d 时，CMC酶、滤纸酶活性达到最大值，其中CMC酶活性最高的是KN，为2.305 IU/mL。LS产CMC酶及滤纸酶的水平显著低于另外3株菌，分别为1.703、0.177 IU/mL，与初筛结果基本吻合。图6"

2.6.3"4株菌株摇瓶复筛产木聚糖酶

研究表明，与HB、KN、LS相比，发酵前期 HQ产木聚糖酶能力最好，摇瓶发酵第4 d时木聚糖酶活性最高可达89.881 IU/mL，产酶时间较其他3株菌更早，但产酶稳定期短暂，达到最高峰后又开始逐步下降。曲霉产孢速度以及生长速度较木霉属更快。KN从发酵第4 d 酶活力开始迅速增长，直至发酵第8 d酶活达到稳定期，微生物转而利用药渣需要适应的过程，一旦适应生长，合成酶的速度会明显提高。将KN与HB进行组合发酵木聚糖酶活力最高可达131.707 IU/mL。 图7

2.7"甘草渣固态发酵产酶

2.7.1"单菌与混菌固态发酵甘草渣产酶变化形态学"

研究表明，黑曲霉固态发酵甘草渣产酶速度较混菌产酶速度更快，当黑曲霉发酵第4 d时，培养基内容物基本变成纯黑色，而混菌发酵直至第7 d时，培养基内容物才能完全变成纯绿色。表3，表4

2.7.2"单菌与混菌固态发酵甘草渣产非淀粉多糖酶对比"

研究表明，随着发酵时间的延长，无论是单菌还是混菌组合，产纤维素酶活力到第8 d开始下降。HB与KN混菌组合发酵产酶效果明显优于HQ单独发酵。表5

单菌在发酵第5 d时产木聚糖酶活力可达77.056 U/g，混菌发酵产酶结果略低于HQ发酵，HQ对半纤维素有较强降解能力，其单独发酵时产木聚糖酶效果良好。表6

3"讨 论

3.1

中药药渣中含有大量的木质素、纤维素和功能性成分，具有较大的开发利用价值［14，15］。研究利用平板对峙试验将不具有拮抗作用的菌株进行组合，并通过初筛与摇瓶复筛，筛选出产酶性能较强的真菌，采用甘草渣固态发酵形式，为微生物提供合适碳源，药渣有潜力实现其高值化利用，成为生产复合酶的低成本底物。菌株对酶有诱导能力，试验研究得出康宁木霉与黄孢原毛平革组合固态发酵甘草渣产酶能力优于黑曲霉单独固态发酵甘草渣。说明混菌发酵产各自优势酶系的同时可实现酶系互补，提高甘草渣生物质利用率。纤维素降解需要3种酶协调配合才能将其转化为葡萄糖，在降解过程中发挥作用的先是内切酶，产物多为纤维二糖、纤维三糖，最终β-葡聚糖苷酶将纤维二糖和水溶性纤维素降解为葡萄糖［16］。半纤维素降解能够增加其他酶与底物的接触机会，而含量较多的半纤维素主要为木聚糖，因此有效水解木聚糖有利于木质纤维类物质的高效利用［17］。目前研究较多的产纤维素酶或半纤维素酶是真菌，真菌比细菌更受青睐，因为其渗透能力和通用的底物消耗能力更强［18-20］。单丽君［21］以干燥柑橘皮为原料生产酶制剂，筛选黑曲、康宁木霉以及里氏木霉的产酶能力，发现木霉生长速度较曲霉和青霉慢，与研究基本一致。田杰［22］以藤茶为基质，通过培养基优化发现黑曲霉在藤茶基质上的产酶特性良好，其中产纤维素酶、木聚糖酶最高可达373.76IU/g、120.33 IU/g。钱静亚等［23］将玉米芯粉和水进行复配，接入黄孢原毛平革菌固态发酵得到的纤维素酶和木聚糖酶分别为2.54、10.86 U/ g，其中在发酵第6 d 时纤维素酶活性迅速上升。邱首哲等［24］利用分离出的扩展青霉与不同类型的药渣进行发酵，其中甘草摇瓶发酵生产的滤纸酶可达1.788 IU/mL，CMC酶为10.935 IU/mL。把真菌混合发酵后，其降解药渣的速率明显高于任何一个单一菌株。夏强［25］发现地衣芽孢杆菌、黑曲霉和绿色木霉组成的细菌-真菌复合菌系产纤维素酶的能力优于单一菌株，复合菌系显著提高了降解水稻、玉米和小麦秸秆的能力，与研究一致。

3.2

复合菌系的构建增加了酶的环境适应性和功能稳定性，弥补了单一菌种的纤维素酶种类不全和纤维素酶配比不协调等缺点，从而提升降解速度［26］。白腐真菌与木霉属可利用自身产酶特性，降解富含丰富综纤维素的农业生物质。例如，张仲卿等［27］拟康宁木霉与黄孢原毛平革菌混合发酵玉米秸秆的效果显著优于单菌发酵玉米秸秆，纤维素和木质素降解率最高分别为36.80%和 28.87%。王志等［28］用拟康氏木霉和白腐菌混合发酵秸秆，发现秸秆的纤维素降解率和木质素降解率分别为40.38%、31.52%，比单独使用拟康氏木霉或白腐菌处理秸秆的效果显著提高。随着培养时间的延长，发酵第8 d开始，菌体可能逐渐老化，产酶能力逐渐下降，所产酶部分失活，从而影响了纤维素和木质素的降解率。甘草渣中纤维素含量48.6%、半纤维素含量可达18.1%［3］。

4"结 论

4株真菌均具有产纤维素酶、木聚糖酶的能力，但产酶速度、能力均有差异。HB、KN 2株菌产酶能力不相上下且相互不存在拮抗作用，可进行混菌发酵降解甘草渣中的木质素和纤维素。HQ单独发酵降解半纤维素能力较强，固态发酵工艺优化还是选用混菌发酵效果更佳。

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Screening of strains producing non-starch polysaccharide enzyme"""by fermentation of licorice residue and its dynamic changes

YANG Yifan1， GAO Yan2， LIU Yanan3， HUO Xiangdong2，""LOU Kai2， GUAN Bo3， CHEN Kaixu1， ZENG Jun2

（1. "College of Animal Science， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052，China; 2. Institute of Microbial Applications， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences/ Xinjiang Special Environment Microbial Laboratory， Urumqi 830091， China; 3. College of Food Science， Shihezi University， Shihezi Xinjiang 832000， China）

Abstract：【Objective】 ""To screen a strain with high yield of non-starch polysaccharide enzyme four fungi in the hope of laying a foundation for the production of non-starch polysaccharide enzyme by solid-state fermentation of licorice residue.

【Methods】 ""Four kinds of fungi （Aspergillus niger， Trichoderma reesei， Phanerochaete chrysosporium and Trichoderma koningii） were primarily screened by Congo red method and filter paper strip disintegration test， and the CMC enzyme， filter paper enzyme and xylanase activities were determined by shake flask fermentation of residue.The strain with the highest enzyme activity was fermented with licorice residue in solid state to verify its enzyme production effect.

【Results】 ""Through the preliminary screening， it was found that all four strains of fungi had the ability to produce cellulase and xylanase.The antagonistic effects between Aspergillus Niger and other three strains was found by plate confrontation test.According to the results of enzyme activity determination， Phanerochaete chrysosporium and Trichoderma koningii produced the highest cellulase than the other two fungi， and the CMC enzyme activity reached 2.10 and 2.31 IU/mL on the fourth day of fermentation.The highest xylanase activity produced by Aspergillus Niger through shake flask re-screening fermentation could reach 97.46 IU/mL. However， the xylanase activity of Phanerochaete chrysosporium and Trichoderma koningii could reach 131.707 IU/mL at the highest.

【Conclusion】 ""The growth cycle of non-starch polysaccharide activity produced by mixed solid-state fermentation of licorice residue with Phanerochaete chrysosporium and Trichoderma koningii is more stable and the yield is higher， therefore， licorice residue， as an agricultural by-product， has the potential to become a low-cost substrate for enzyme production in the future.

Key words：""licorice residue; cellulase; xylanase; solid state fermentation

Fund projects：""Xinjiang Uygur Autonomous Region key research and development plan project sub-topic （2022B02057-1）;The Science and Technology Action Project for the Development of Rural Industries in Xinjiang Uygur Autonomous Region （2022NC073）

Correspondence author：""CHEN Kaixu（1983-）， male，Lecturer， Ph.D.， Master's Supervisor， specializing in livestock and poultry genetic breeding and animal nutrition，（E-mail）chenkaixu@126.com

ZENG Jun（1982-）， male，Associate Researcher， Ph.D.， Master's Supervisor， specializing in the exploration and application of special environmental microbial resources in Xinjiang，（E-mail）leo924.student@sina.com

收稿日期（Received）：

2024-03-27

基金项目：

新疆维吾尔自治区重点研发计划项目子课题（2022B02057-1）;新疆维吾尔自治区乡村振兴产业发展科技行动项目（2022NC073）

作者简介：

杨奕凡（1999-），女，硕士研究生，研究方向为动物营养与饲料，（E-mail）623802746@qq.com

通讯作者：

陈开旭（1983-），男，讲师，博士，硕士生导师，研究方向为畜禽遗传育种及动物营养，（E-mail）chenkaixu@126.com

曾军（1982-），男，副研究员，博士，研究方向为新疆特殊环境微生物资源挖掘及应用，（E-mail）leo924.student@sina.com