大理州4县(市)家畜布鲁氏菌病血清学调查与分析

赵灿奇

(大理州动物疫病预防控制中心,云南 大理 671005)

布鲁氏菌病(简称布病),是一种由布鲁氏菌引起的人畜共患病[1],世界动物卫生组织(WOAH)将其列为必须通报的重要动物疫病,我国将其列为二类动物疫病[2,3]。动物布鲁氏菌病主要侵害动物生殖系统,以母畜流产和公畜睾丸炎为主要特征,人可通过接触病羊、病牛及其流产物,或摄入带菌产品而感染[4]。布鲁氏菌病不仅严重阻碍畜牧业稳定健康发展,同时严重威胁到人民群众生命财产安全。大理州牛、羊、猪存栏量居全省前列,2022年末,大理州生猪存栏245.14万头(其中能繁母猪22.07万头),肉牛存栏79.87万头,奶牛存栏8.16万头,羊存栏157.13万只,家禽存栏1885.25万羽。随着养殖业的不断发展壮大,动物交易越来越频繁,同时也增加了人畜共患病发生的概率。特别是自2010年以来,大理州人畜布鲁氏菌病疫情开始反弹,并高位维持,防控形势十分严峻。为了解和掌握大理州畜间布鲁氏菌病的流行情况,本试验采用布鲁氏菌荧光偏振试验(FPA)初筛和微量法补体结合试验(mCFT)[5]确诊的方法,对大理州大理市、宾川县、洱源县、剑川县2022年留存的7655份动物血清(其中牛血清5467份、羊血清1962份、猪血清226份)进行布鲁氏菌病抗体检测,对检测结果进行分析与统计,了解和掌握大理州动物布鲁氏菌病流行情况,为全州动物布鲁氏菌病的控制和净化提供基础数据和技术支撑。

1 材料方法

1.1 样品采集

按照《2022 年大理州畜间布鲁氏菌病监测净化方案》的相关要求和抽样数量,结合大理、宾川、洱源、剑川4个县(市)养殖存栏等实际情况,2022年9—11月间在上述4县(市)范围内根据“按养殖规模分配+阳性群跟踪监测”的采样模式,选取牛存栏50头以上,羊存栏100只以上的17个规模化养殖场;选取与流行病学相关联的9个村(近5年来发生过人畜间布鲁氏菌病病例),猪存栏5头以上,牛存栏2头以上,羊存栏10只以上的476户养殖户,采集血清样品。共采集了7655份动物血清样品(规模场5044份,散养户2611份),其中牛血清5467份,采自大理、宾川、洱源、剑川4个县(市)的13个规模养殖场和181户养殖户;羊血清1962份,采自大理、宾川、洱源、剑川4个县(市)各乡(镇)不同日龄羊的4个规模场、238户养殖户;猪血清226份,采自大理、宾川、洱源3县(市)的57户养殖户,具体样品信息见表1。

表1 样品信息表

1.2 主要试剂和仪器

FPA试剂盒,批号202303;mCFT用补体、溶血素、抗原、多功能酶标与荧光偏振仪(TECAN SPARK CYTO)、洗板机(Ts-20)等均由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室(北方)提供。

1.3 FPA检测

取反应板,将7655份待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清分别加入ELISA抗原包被板中,20μL/孔,其中阴性对照血清各加3孔、阳性对照血清加1孔,加样过程要尽量避免产生气泡。每孔加180μL样品稀释液,充分混匀。室温下孵育反应板3～5min。读取每孔的空白值。每孔立即加入10μL荧光标记抗原,充分混匀。室温下孵育反应板3～5min。读取每孔偏振值。FPA判定标准为△mP值≥20mP时,为布鲁氏菌病抗体阳性(+);△mP值<20mP时,为布鲁氏菌病抗体阴性(-)[6]。

1.4 mCFT检测

对FPA初筛阳性的血清,采用mCFT进行确诊。在测定溶血素、补体、抗原最佳使用浓度的基础上,将待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清在96孔深孔稀释板中用生理盐水作1∶10稀释,放入水浴锅中58℃灭能30min。然后取96孔U型底微孔板按表2进行临床样品的检测,用酶标仪读取并记录各孔的OD600 nm值并判定结果。阳性血清加抗原对照孔和溶血素对照孔,须完全抑制溶血;阴性血清不加抗原对照孔和其他对照孔完全溶血,试验成立。被检临床血清不加抗原对照孔应完全溶血,表明反应结果符合要求,可判定被检临床血清加抗原检测孔结果,制作并对比标准比色孔OD600 nm值判定结果[4]。100%溶血判定为阴性,50%～90%溶血判为可疑,0%～40%溶血判为阳性。

表2 临床样品的检测 单位：μL

2 检测结果

2.1 FPA检测结果

采用FPA对7655份动物血清样品进行检测,结果显示,3个县(市)猪血清样品FPA初筛结果均为阴性;牛血清样品仅宾川县检测出1份阳性,其余3个县(市)均为阴性;羊血清样品阳性率最高,洱源县阳性率10%(26/260),宾川县阳性率4.54%(35/772),其余2县(市)均为阴性。具体检测结果见表3。

表3 FPA布鲁氏菌病检测结果记录表

2.2 mCFT 检测结果

对FPA初筛的62份阳性血清样品(其中牛血清1份,羊血清61份),采用mCFT进行确诊,结果见表4。其中55份羊血清样品经mCFT确诊为阳性,其余均为阴性。经mCFT确诊后,4个县(市)猪血清样品、牛血清样品个体阳性率均为0,羊血清样品个体阳性率为2.8%(55/1 962)。

表4 mCFT检测结果记录表

3 讨论

我国现行的动物布鲁氏菌病诊断技术(GB/T 18646—2018)规定了多种动物布鲁氏菌病血清学检测方法,包括RBT、SAT、MRT、CFT、iELISA、cELISA等试验方法[5,7],但目前大理州的动物布鲁氏菌病检测仍然在沿用20世纪六七十年代开发的传统凝集类试验方法,即RBT初筛、SAT确诊,主要是由于RBT、SAT检测试剂的成本相对新方法低。这两种方法都有其优缺点,RBT具有操作简便,节约检测成本,检测敏感性较高的优点[7-9],但RBT的检测结果易受诊断抗原质量的影响,出现假阳性或假阴性[10];SAT受IgM类抗体影响大[11],特异性和敏感性较低,容易出现漏检,且结果判定受人为主观因素影响,凝集类试验的敏感性和特异性相比FPA和ELISA等方法低,且不适合大规模样品检测。在WOAH手册中目前已不推荐SAT作为布鲁氏菌病血清学诊断方法,仅用于布鲁氏菌病阳性血清的效价标定。FPA方法敏感性及特异性与ELISA相当,该方法最大的优点在于快速高通量,检测92份样品仅需15min,适合大量样品的布鲁氏菌病血清学筛查。mCFT相比常量法CFT操作更简便,是国际公认的布鲁氏菌病血清学确诊的金标准。所以本试验采用FPA进行血清样品布鲁氏菌抗体初筛,对于初筛阳性的样品再采用mCFT确诊,极大提高了检测效率和准确性。

本试验检测结果表明,4县(市)猪血清样品与牛血清样品的布鲁氏菌病个体阳性率均为0,这主要与样品来源、样品量存在一定的关系。此次检测样品中的牛血清样品主要来源于规模化奶牛养殖企业,本次试验的猪血清样品均采自养殖户,且样品数量较少,检测结果存在一定的局限性。因此,大理州猪群与牛群布鲁氏菌病流行的真实情况还需要更多监测数据的验证。检测结果表明大理州4县(市)的家畜布鲁氏菌病主要以羊布鲁氏菌病为主,阳性率达2.8%(以mCFT检测结果确诊),阳性样品均采自养殖户,这与我国动物布鲁氏菌病主要以羊布鲁氏菌病为主的流行情况基本一致。大理州由于畜禽养殖比较密集、规模化程度较低、动物频繁调运、生物安全防范能力不高等因素,导致畜间布鲁氏菌病急剧传播和上升,严重威胁着公共卫生安全。因此做好动物布鲁氏菌病防控,特别是羊布鲁氏菌病的准确诊断是减少人间布鲁氏菌病发病数的有效手段。

布鲁氏菌病阳性动物是重要传染源,不论是在家畜引种过程中,还是畜群布鲁氏菌病净化过程中,阳性动物的漏检将对同场群的易感动物造成巨大的感染风险,如何快速、准确的检测是控制和净化布鲁氏菌病的重要环节之一。大理州现阶段采取的动物布鲁氏菌病防控政策是“检验—淘汰”策略,在布鲁氏菌病防控实践中,因检测方法的问题常常会导致误诊和漏诊的现象存在,从而引起误杀或传染源不能及时剔除出群,严重阻碍了布鲁氏菌病的有效防控和净化。因此,要尽快建成完善的州、县、乡动物疫病监测体系,加快高效准确诊断试剂的推广应用,更新动物布鲁氏菌病检测技术。应尽快在全州逐步推广应用高通量、高敏感特异的诊断方法,如推广布鲁氏菌病竞争ELISA试剂盒或布鲁氏菌病荧光偏振抗体检测试剂盒进行布鲁氏菌病阳性动物筛查,再采用牛/羊布鲁氏菌病间接ELISA试剂盒进行确诊[12]。

建议大理州加大监测力度和范围,及时对调入牛羊、引起人感染布鲁氏菌病和高流产率畜群等开展排查、隔离、采样、检测和报告工作。定期开展诊断技术培训和宣传活动,不断提高县(市)级动物疫控中心技术人员和村防疫员的理论水平和实践操作能力,在今后的临床诊断与疫病净化过程中,要在结合当地布鲁氏菌病流行情况,联用几种不同的检测方法,尽可能减少阳性动物的漏诊,从而做到及时、准确的确诊。同时加强对养殖场(户)等重点人群的宣传和专业知识培训。让广大群众充分认识布鲁氏菌病对人畜的危害,提高对布鲁氏菌病的自我防护意识。