以丝瓜络为碳源的固相反硝化系统性能

高书伟， 张 凯， 李志斐， 谢 骏， 王广军， 郁二蒙，李红燕， 夏 耘， 田晶晶， 龚望宝*

(1. 中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东 广州 510380；2. 上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306)

近年来，我国水产动物蛋白生产领域发展迅猛，水产品总产量已超过世界总产量的一半以上[1]。水产养殖在提供大量优质蛋白质的同时，由于大量的饲料投入以及鱼虾排泄物的产生导致养殖水体氮素积累超负荷，影响了养殖环境和水产品质量安全[2]，养殖尾水直接外排也会引起严重的环境问题[3]。异养反硝化去除水体硝酸盐(NO3−-N)最具经济环保的方法之一，然而水体碳氮比(C/N)是制约异养反硝化脱氮效果的关键因素[4]。通常养殖尾水的碳氮比在1.0～2.0(质量比)，碳源不足严重制约了反硝化进程[5]。因此，对养殖尾水进行深度脱氮往往需要外加碳源。

传统外加碳源多为甲醇、乙醇和乙酸等液体碳源和人工合成聚合物如PCL、PLA等固体碳源，因其存在成本高、难操作、易造成二次污染、运输和储存复杂等问题，阻碍了其广泛应用[6-7]。农业废弃物是一类以纤维素为主的天然材料，由于廉价易得、经济环保，且具有较大的比表面积适合微生物附着生长等优点而备受关注[8-9]。然而，水力停留时间(hydraulic retention time, HRT)和进水硝酸盐浓度(influent nitrate concentration, INC)是影响以农业废弃物为碳源的固相反硝化系统性能的关键因素[10]。当HRT较短时，单位时间内进入反应器的氧气量增加会抑制反硝化的进行，同时反硝化细菌和水体接触时间较短会造成脱氮不完全[11]。随着HRT的增加，脱氮效果随之也提高，但过长的HRT也会降低系统的处理效率[12]。Blackmer等[13]的研究表明，INC会影响反硝化系统的脱氮性能，高浓度的NO3−-N通过抑制氮气的生成，转而生成一氧化二氮来影响反硝化。通常INC的升高能增加单位时间内NO3−-N的去除量，随着INC的降低则会出现相反的结果[10]。这主要是因为高的INC提供了更多的电子受体，单位时间内减少的NO3−-N质量增加[14]。

丝瓜络(loofah sponge, LS)作为一种常见的农业废弃物，富含纤维素、半纤维素和木质素，能够持久释放碳源，且具有多层纤维网状结构[15]，已被证明是一种理想的固体碳源[8]。然而关于HRT和INC对丝瓜络反应器反硝化性能的影响少有报道。本研究的主要目的是构建以丝瓜络为碳源的固相反硝化系统，并探究在不同HRT和INC下该系统的反硝化性能，并通过电子显微镜观察了丝瓜络表面结构变化情况，应用高通量测序技术分析了反应器运行初期和末期的细菌群落结构组成。本研究结果为丝瓜络作为反硝化碳源在水产养殖尾水反硝化工艺的进一步优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器

丝瓜络采自广州市某农村，将丝瓜络剪切为约1 cm3大小，用超纯水洗涤2遍，之后60 °C烘干放于密封袋中备用。反硝化污泥采自中国水产科学研究院珠江水产研究所多年未清理的池塘底泥，用纱布(16目)过滤去除杂质。合成水产养殖尾水(synthetic aquaculture wastewater，SAW)按照Li等[16]的方法用纯水配制，每升SAW中氮磷化合物含量如表1所示，NO3−-N浓度根据实验需求进行调整，亚硝酸盐(NO2−-N)为2.5 mg/L，氨氮(NH4+-N)为5.5 mg/L，总磷(TP)为23.88 mg/L，其中每升SAW中微量元素体积占比2 ‰(2 mL)，实验所需化学药品(分析纯)购于上海麦克林生化科技股份有限公司。

表1 人工合成养殖废水组成Tab. 1 Composition of synthetic aquaculture wastewater

实验用仪器为YSI Professional Plus系统(YSI Incorporated，美国)，蠕动泵 (WT-600CAS/353Y型，北京)，COD测定仪 (DRB200/DR900，美国)，TN测定仪 (LH-25A/LH-3BN，北京)，酶标仪(Multiskan FC，上海)。

1.2 反应器建立及运行

如图1所示，以圆柱形有机玻璃容器作为反硝化反应器 (denitrification reactor，DR；直径10 cm，高55 cm)，进水方式为下进上出式，进水口位于底部向上5 cm处，出水口位于顶部向下5 cm处。用废旧毛巾(100×40 cm)包裹40 g丝瓜络和200 mL反硝化污泥置入反应器内，有效容积为(2800±100) mL，每组设置3个重复，蠕动泵控制进水流速来调整HRT。为确保实验数据的有效性及反应器的规模化运行，本研究在室内进行，温度为(22±2) °C，光照强度为(355 ± 31) Lux。LS-DR0表示丝瓜络反应器运行初期，LS-DR14表示反应器运行末期(INC为50 mg/L，HRT为24 h)。

图1 反硝化系统示意图Fig. 1 Schematic diagram of denitrification system

HRT对LS-DR反硝化性能的影响向LS-DR中加满SAW (NO3−-N=50 mg/L)，静置，当NO3−-N完全去除，且无NO2−-N积累，认为驯化成功。之后维持INC为50 mg/L，分别在4个HRT(16、20、24和28 h)下运行14 d，每2天定时测定出水NO3−-N、NO2−-N、NH4+-N、TN、TP、COD和溶解氧(DO)浓度以及pH值。

INC对LS-DR反硝化性能的影响驯化方法同上，在最佳HRT的基础上，分别在3个INC(75、100和125 mg/L)下运行14 d，每2天测定出水NO3−-N、NO2−-N、NH4+-N、TN、TP、COD和溶解氧(DO)浓度以及pH值。

LS-DR微生物群落结构分析HRT实验结束后，分别收集LS-DR0和LS-DR14的污泥样品进行细菌群落多样性分析。提取DNA后，以“CC TACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”为上游引物，“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”序列为下游引物对原核生物16SrDNA的V3及V4高度可变区进行扩增。PCR扩增采用25 μL反应体系，包括上下游引物各1 μL、dNTPs 2 μL、TransStart Buffer 2.5 μL、TransStartTaqDNA 0.5 μL和模板DNA 20 ng，之后用dd H2O补充体系。高通量测序文库的构建和基于Illumina MiSeq平台的测序由苏州帕诺米克生物科技有限公司完成。

丝瓜络表面结构分析分别收集LS-DR0和LS-DR14的丝瓜络在烘箱中烘干(60 °C)。利用扫描电子显微镜(SEM)(QUANTA 250, Servicebio Co.,中国)观察其表面结构变化。

1.3 分析方法

水样经0.45 μm滤膜[Pall 颇尔 ( 中国 )有限公司]过滤后测定NO3−-N、NO2−-N和NH4+-N。采用YSI Professional Plus系统测定DO和pH，使用重铬酸钾法测定COD浓度；采用过硫酸钾消解法测定TN和TP；NO3−-N的测定采用麝香草酚分光光度法；NO2−-N的测定采用N-(1-萘基)乙二胺光度法；NH4+-N的测定采用水杨酸分光光度法。

所有数据以“平均值±标准差”的形式表示，采用SPSS 26.0对COD、TN、TP和NO3−-N等指标进行单因素方差分析，当P＜ 0.05时，存在统计学差异。使用GraphPad棱镜8.0.2和Excel 2010作图。

2 结果

2.1 丝瓜络表面结构变化

运行初期，通过100倍SEM观察丝瓜络运行结果如图版-1所示，发现其表面呈褶皱状，具有较大的比表面积和粗糙度，适合微生物的生长附着。在500倍下，丝瓜络表面则相对平整(图版-3)。经过14 d运行后，从图版-4 可以看出其表面结构被水解，显露出不规则的片状突起。此外，表面附着一些细菌和杂质，说明丝瓜络是良好的生物载体，附着细菌也能促进碳源的释放及反硝化的进行。

2.2 HRT对NO3−-N、NO2−-N、NH4+-N、TN、TP和COD的影响

整个实验期间，LS-DR的DO均低于1 mg/L，pH在6.50～7.20。如图2-a所示，INC为50 mg/L时，不同HRT下，出水硝酸盐浓度(effluent nitrate concentration，ENC)均大幅度降低。HRT为16、20、24和28 h时，NO3−-N去除率分别为69.19%±4.59%、82.65%±3.62%、98.97%±0.52%和98.62%±1.33%。单因素方差分析显示，HRT在16～24 h，NO3−-N去除率随HRT的延长而显著升高 (P＜0.05)。当HRT从24 h增加到28 h时，NO3−-N去除率维持稳定(P=0.80)，说明HRT在24 h时，LS-DR已能达到最佳的NO3−-N去除效果。NO2−-N的变化与ENC有相似趋势，说明NO2−-N积累量与ENC呈正相关，当HRT为16和20 h时，NO2−-N分别为(5.19±1.52)和(1.39±0.49) mg/L(图2-a)，当增加至24和28 h时，NO2—N低于0.5 mg/L，说明可以实现完全反硝化。在进水NH4+-N浓度为5.50 mg/L的情况下， LS-DR均能够将其完全去除。TN的去除过程与NO3−-N有相似的规律 (图2-b)，当HRT为16和20 h时，TN去除率分别为73.30%±7.21%和70.67%±6.30%，延长至24 h后，TN去除率达到最高(97.84%±0.94%)，显著高于其他HRT (P＜0.05)。综合以上分析， 本研究中LS-DR的最佳HRT为24 h。

图版 实验前(1、2)后(3、4)丝瓜络表面结构扫描电镜观察结果1，3. LS-DR0；(2)(4) LS-DR14.Plate SEM observation results of surface structure of LS before (1, 2) and after (3, 4) the experiment

图2 不同HRT下LS-DR对含氮磷污染物的去除性能Fig. 2 Removal performance of LS-DR for nitrogen and phosphorus pollutants at different HRT

TP随HRT的变化曲线如图2-b所示，HRT在16～28 h时，TP 去除率为88%～89%，无显著差异(P＞0.05)。如图2-c所示，COD随HRT的增加呈先降低后升高的趋势，分别为(77.42±16.66) mg/L(HRT=16 h)、(32.25±9.33) mg/L (HRT=20 h)、(26.52±10.52) mg/L (HRT=24 h)和(44.24±10.88) mg/L(HRT=28 h)，其中HRT为16 h时，COD的利用率较低，出水COD显著高于其他HRT (P＜0.05)，但HRT在20 、24 和28 h时出水COD无显著差异 (P＞0.05)。

2.3 INC对NO3−-N、NO2−-N、TN、TP和COD的影响

在最佳HRT(24 h)的基础上，当 INC为75、100和125 mg/L 时，ENC随INC的增加而增加(图3-a)，分别为(24.89±2.91)、(26.91±0.94)和(27.55±2.78) mg/L，无显著差异 (P＞0.05)。NO3−-N去除率随INC增加而大幅度增加，当INC为125 mg/L时，NO3−-N去除率(77.96%±2.22%)显著高于INC为75 mg/L (66.81%±3.88%)和100 mg/L(73.09%±0.94%)时的去除率 (P＜0.05)。同样，NO3−-N去除速率(nitrate removal rate, NRR)也随INC提高而显著增加 (P＜0.05)，当INC为75、100和125 mg/L时，NRR分别为(50.11±2.91)、(73.09±0.94)和(97.45±2.78) mg/(L·d)，说明INC能够显著影响LS-DR的NO3−-N去除率和NRR。如图3-a所示，NO2−-N与NO3−-N有相似的变化趋势，然而，INC为75、100和125 mg/L时，NO2−-N均出现积累，分别为3.80±1.22、5.37±0.75和5.67±0.07 mg/L，说明INC在75至125mg/L范围内，LS-DR均不能实现完全反硝化。不同INC下，TN的变化曲线如图3-b所示，分别为(29.65±3.16) mg/L (INC=75 mg/L)、(37.77±3.56) mg/L (INC=100 mg/L)和(40.27±7.12) mg/L (INC=125 mg/L)，对应去除率分别为64.28%±3.81%、65.03%±3.29%和69.72%±5.35%，各组之间无显著差异 (P＞0.05)。结合上述结果，本实验认为在最佳HRT(24 h)的基础上，当INC为50 mg/L时，LS-DR的NO3−-N处理能力达到饱和。

图3 不同INC下LS-DR 对含氮磷污染物的去除性能Fig. 3 Removal performance of LS-DR for nitrogen and phosphorus pollutants at different INC

TP的变化曲线如图3-b所示，不同INC下，TP去除率在81%～82%，各组之间无显著差异(P＞0.05)，说明INC对TP的去除效果影响不大。如图3-c所示，COD随INC的增加出现降低，INC为75 mg/L时，出水COD为(55.05±15.90) mg/L，显著高于INC为100 mg/L [(33.14±12.58) mg/L]和125 mg/L [(26.67±15.66) mg/L]时，说明INC对出水COD也有明显影响。

2.4 LS-DR微生物群落结构分析

LS-DR运行前后微生物多样性指数变化对原始序列进行质控后，分别获得49881和52389个高质量序列，共归入5202和4247个OTU。所有样本Coverage指数大于0.98，说明测序序列几乎覆盖所有的细菌，测序结果具有可靠性和代表性 (表2)。LS-DR经过14天运行后，其Observed-species、Chao1、Shannon指数和ACE指数均降低，说明细菌群落多样性和均匀性改变，其物种数目、丰富度和均匀度降低，部分细菌被富集。

表2 细菌群落α多样性指数Tab. 2 The α diversity index of bacterial community

门水平上的微生物群落结构对OTU代表序列进行门水平上的分类，如图4-a所示。LSDR运行初期及末期的优势菌在结构组成上有一定的相似性，包括变形菌门 (Proteobacteria)、盐杆菌门 (Halobacterota)、拟杆菌门 (Bacteroidetes)、脱硫细菌门 (Desulfobacterota)、弯曲杆菌门 (Campilobacterota)、厚壁菌门 (Firmicutes)、Sva0485、绿弯菌门 (Chloroflexi)和疣微菌门(Verrucomicrobiota)等，但其相对丰度具有差异，运行初期，它们的相对丰度分别为15.53%、14.68%、4.61%、8.35%、0.13%、1.69%、4.99%、4.19%和2.27%。运行14 d后，变形菌门、拟杆菌门、弯曲杆菌门、厚壁菌门和疣微菌门分别增至33.46%、10.66%、0.34%、2.74%和2.40%，相反，盐杆菌门、脱硫细菌门、Sva0485、绿弯菌门分别降至7.58%、6.10%、3.65%和1.97%。整体来说，碳源的持续释放以及硝酸盐的注入导致LS-DR内的部分细菌被富集。

图4 LS-DR0和LS-DR14在门 (a)和纲 (b)水平上的相对丰度Fig. 4 Relative bacteria abundance ofLS-DR0 and LS-DR14 at phylum (a) and class (b) levels

纲水平上的微生物群落结构如图4-b所示，LS-DR14的优势纲为γ-变形菌纲 (Gammaproteobacteria，31.69%)、拟杆菌纲 (Bacteroidia，10.41%)、Methanosarcinia (9.27%)、Thermodesulfovibrionia(5.38%)、弯曲菌纲 (Campylobacteria，0.34%)、甲烷微菌纲 (Methanomicrobia，3.05%)、梭状芽孢杆菌纲(Clostridia，1.97%)、Desulfobacteria (3.15%)、α-变形菌纲 (Alphaproteobacteria，1.76%)等。相比LS-DR0，γ-变形菌纲、拟杆菌纲、弯曲菌纲、梭状芽孢杆菌纲和α-变形菌纲的相对丰度增加，Methanosarcinia、Thermodesulfovibrionia、甲烷微菌纲和Desulfobacteria则降低。

属水平上的微生物群落结构在属水平上进一步对OTU进行分类，可以观察到细菌群落结构更详细的差异 (图5)。LS-DR运行初期的优势菌属为鬃毛甲烷菌属 (Methanosaeta，9.26%)、甲烷绳菌属 (Methanolinea，3.19%)、Desulfatiglans(2.90%)、Candidatus_Competibacter(2.27%)、Methanoregula(2.07%)、Sva0081_sediment_group (1.54%)、Geothermobacter(1.43%)、unidentified_Thermodesulfovibrionia(1.00%)、ADurb.Bin063-1 (0.86%)和莫拉菌属 (Moraxella，0.72%)。然而，LS-DR运行14 d后，优势菌属出现明显改变，为热单胞菌属 (Thermomonas，1.46%)、陶厄氏菌属 (Thauera，0.55%)、固氮螺菌属 (Azospira，3.32%)、Simpli-cispira(1.01%)、草螺菌属 (Herbaspirillum，3.02%)、Cloacibacterium(2.69%)、假黄色单胞菌属 (Pseudoxanthomonas，0.39%)、Uliginosibacterium(0.9%)、Lacunisphaera(1.02%)、Cytophaga xylanolytica(1.61%)、黄杆菌属 (Flavobacterium，1.17%)、Diaphorobacter(0.64%)和Macellibacteroides(1.59%)。

图5 基于属水平上LS-DR0和LS-DR14的物种丰度聚类热图Fig. 5 Heat map of species abundance clustering of LS-DR0 and LS-DR14 based on genus level

3 讨论

3.1 LS-DR的反硝化性能

厌氧和弱酸性条件有利于反硝化的进行[17-18]，实验期间，LS-DR内环境条件均达到此标准。本研究中，HRT为24 h时，LS-DR的反硝化性能最佳，这一结果与栾晓男等[19]的研究结果一致，以丝瓜络作为反硝化滤池填料，水力停留时间为24 h时，对生活污水中各污染指标去除效果达到最好。钟华等[20]报道玉米芯固相反硝化系统的最佳水力停留时间为16 h，而腐朽木作为缓释碳源外加到硝化滤池，在初始阶段HRT为12 h的脱氮效果最佳[21]。碳源的种类及添加量、反应器的理化状态、进水特性以及温度等因素均能影响添加碳源的反硝化系统的反硝化性能[22-24]。本研究中，当HRT达到24 h后，系统反硝化性能并未随着HRT的增加而显著增加，在以废活性污泥的热水解液和产酸液为反硝化碳源时也有相似的发现[25]。这是因为过长的HRT导致NO3−-N的相对流入量减少，抑制了反硝化细菌的活性，导致NO3−-N去除率并未显著增加[26-27]。同时过长的HRT促进了有机底物的进一步发酵和水体中较小的胶体和可溶性有机物 (粒径＜0.45 μm)的释放[27]，导致出水COD浓度也出现一定量的回升。

本研究在最佳HRT条件下，当INC为50 mg/L时，LS-DR的反硝化性能最佳。HRT是影响反硝化系统最佳INC的关键因素。以玉米芯为碳源的反硝化系统在HRT为16 h时， INC为50 mg/L时具有最佳反硝化效果[20]，而以羟基丁酸戊酸共聚酯为碳源的反硝化系统在HRT为7.25 h时的最佳INC为100 mg/L，并随着HRT的变化，反硝化系统的最佳INC发生改变[28]。董全宇等[29]报道木屑-硫磺填充床反硝化生物滤池在HRT为10 h条件下，INC为30 mg/L时的反硝化性能最好。LS-DR的NRR随着INC的增加而增加，这一结果与Hoover等[30]的研究结果相似，以木片为反硝化系统外加碳源，INC从10增至50 mg/L后，出水NO3−-N逐渐增加，单位时间内NO3−-N去除量从7.5增加到12.9 mg/L。这主要因为随着INC的提高，反应器单位体积内电子受体增加，有效反硝化的NO3−-N质量也随之增加，单位时间内减少的NO3−-N质量也增加[10]，同样的，有机物作为反硝化的电子供体，其消耗量也会增加，因此出水COD呈下降趋势。

3.2 LS-DR的微生物群落结构分析

LS-DR运行14 d后细菌群落结构发生改变。其中变形菌门普遍存在环境中，是反硝化细菌的主要来源[31]，其在制药、炼油、食品等工业废水和城市污水[32]以及水产养殖尾水[5]中均是促进反硝化的优势类群。隶属变形菌门的γ-变形菌纲和α-变形菌纲包含丰富的硝化细菌、厌氧氨氧化细菌和NO2−-N氧化细菌[33]，是LS-DR脱氮的主要参与者，在麦秸秆、棉花、废报纸和聚丁二酸丁二醇酯为碳源的人工湿地中均是优势纲[34]。拟杆菌门也普遍存在生态系统中参与氮循环和能量转换[35]，其中拟杆菌纲有反硝化功能[36]。此外，拟杆菌门中还存在分解蛋白质、纤维素和脂质等大分子有机物的细菌[27]，促进了丝瓜络的分解。以丝瓜络为填料的反硝化滤池中也发现拟杆菌门大量存在[37]。厚壁菌门中也存在参与反硝化和纤维素降解的细菌，曾在生活污水处理系统中被发现[38]。绿弯菌门在反硝化过程中的具体作用并没有报道，但亚硝酸盐氧化菌已经从绿弯菌门中分离出来[39]，具有一定参考性。疣微菌门中存在具有较高木质素降解能力的细菌[40]，主要促进丝瓜络降解。

在被鉴定的优势属中假黄色单胞菌能够还原NO2−-N，但不能还原NO3−-N[41]，Diaphorobacter和黄杆菌均能降解丝瓜络并进行反硝化，以往研究发现，上述三类菌属在聚羟基丁酸戊酸共聚酯支撑的养殖尾水处理系统运行中后期成为优势菌属[42]，这与本研究相似；Cytophaga xylanolytica能在严格厌氧下分解木聚糖等多糖[43]，对丝瓜络的降解有重要作用；热单胞菌属和陶厄氏菌属是常见的反硝化菌属[44]，在以猪粪为碳源处理养猪尾水的过程中被富集[45]。有趣的是，有研究发现陶厄氏菌在以纤维素类材料为碳源的人工湿地中被富集，而在可降解聚合物为碳源的人工湿地中减少[34]，说明丝瓜络对反硝化菌有选择性。Simplicispira在玉米芯支撑的人工湿地中是优势反硝化菌属[46]，在本研究中同样被发现。草螺菌属和Uliginosibacterium均为好氧反硝化菌[47]，曾在城市污水处理厂中发现[48]，可能导致反应器内低溶氧条件。Cloacibacterium主要参与丝瓜络的降解，其对玉米芯[49]、羟基丁酸和羟基戊酸共聚物[50]也有降解作用。综合来看，这些富集菌属共同促进了丝瓜络的降解和反硝化的进行。添加CH3COONa[51]、小麦秸秆、棉花、聚琥珀酸丁二烯和报纸[34]的反硝化系统中均富集了反硝化功能属。相反，甲烷鬃菌属、甲烷绳菌属和Methanoregula等一些产甲烷古细菌在LS-DR内丰度降低，这可能是有机物浓度的增加对它们的生长代谢有抑制作用[52]，在同步反硝化产甲烷系统中也有类似现象发生[53]。

4 结论

INC为50 mg/L，HRT为24 h时，LS-DR的反硝化性能最佳，NO3−-N去除率达到98.97%±0.52%，TN去除率达到97.84%±0.94%，NO2−-N处于较低水平(＜0.5 mg/L)，能够实现完全反硝化。在HRT为24 h的基础上，当INC分别增加至75、100和125 mg/L时，LS-DR的NO3−-N去除率和NRR均随INC的增加而增加，出水COD随INC的增加而降低，但均未实现完全反硝化。

在HRT为24 h，INC为50 mg/L条件下运行14 d后，LS-DR内细菌群落结构发生改变，优势菌门包括变形菌门、拟杆菌门、弯曲杆菌门、厚壁菌门和疣微菌门。被鉴定的优势菌属中热单胞菌属、陶厄氏菌属、固氮螺菌属、Simplicispira、假黄色单胞菌属、草螺菌属和Uliginosibacterium能够进行反硝化，Cytophaga xylanolytica和Cloacibacterium主要参与了丝瓜络的降解，Diaphorobacter和黄杆菌既能进行反硝化，也能降解丝瓜络。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）