基于多元统计分析的“紫脉龙韵”苦茶主要滋味品质评价

吴玲玲，黄静，巫虹颖，梁贤智，翁小婷，骆妍妃，农玉琴，王明释，陈远权

（广西南亚热带农业科学研究所，广西崇左 532415）

苦茶（Camelliasinensisvar.kucha）是我国特有的一类茶树资源，含有特殊的嘌呤生物碱—苦茶碱，其具有独特的品质风味和保健功效[1]，近年来，逐渐成为茶叶领域的重点研究对象。关于苦茶资源的鉴定[2]、代谢组学[3⁃4]、转录组学[5⁃6]、保健功效评价[1]、遗传多样性分析[7]、苦茶碱合成途径[8]等相关研究日益增多。目前，研究较多的是广东、云南、湖南、四川、福建等地区的苦茶[9]，广西苦茶资源相对稀缺，相关研究鲜有报道。“紫脉龙韵”是课题组前期筛选出的苦茶品种，该品种产量较高、持嫩性较强、新梢花青甙略显紫色，抗性与生长势综合表现优良，其滋味品质成分有待研究。

苦茶芽叶滋味极苦，经过一定的加工处理后，制成的茶叶仍具有一定的苦味。研究表明，茶汤的苦味主要是茶多酚、生物碱、儿茶素、花青素等多种物质共同作用的结果[10]。茶树鲜叶是制备茶叶的原料，嫩度不同的鲜叶，其物质基础不同[11]，加工而成的茶叶品质也不同。茶叶品质的好坏及其适制性与鲜叶滋味物质密切相关[12⁃13]。对不同嫩度鲜叶进行综合评价与分类，以便制定相应的标准化工艺加工出不同等级的茶叶。常规茶树品种嘌呤生物碱以咖啡碱为主，然而，随着健康生活理念的普及，人们对低咖啡碱功能性茶叶产品的需求逐渐增加。苦茶中存在与传统茶叶不同的嘌呤生物碱模式，苦茶碱含量相对较高。尽管苦茶碱与咖啡碱在结构上相似，但其不具有咖啡碱的刺激性，具有镇静催眠、抗抑郁、消炎及镇痛等生理活性[14]。因此，开发富含苦茶碱的适制茶类及功能成分产品不仅能满足一些特殊人群对茶叶的需求，还能提高苦茶资源的利用价值和经济效益。地区及茶树组织部位的不同，嘌呤生物碱的含量及分布亦不同。福建云霄苦茶和安溪苦茶春梢随叶位增加，其苦茶碱含量随之增加，而大田苦茶不同叶位苦茶碱含量的变化趋势表现为先增大后减小[11]。秃房茶中苦茶碱含量随芽叶成熟度的增加而升高[15]，广东苦茶中苦茶碱随叶片成熟度的增加而缓慢降低[16]。

基于此，本研究以“紫脉龙韵”苦茶为研究对象，对不同嫩度鲜叶及不同部位进行主要滋味品质成分的测定，并运用单因素方差、聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、相关性分析及主成分分析（principal component analysis，PCA）等多元统计分析方法明确“紫脉龙韵”苦茶鲜叶嫩度差异的关键化合物、不同嫩度鲜叶的分类及不同部位嘌呤生物碱分布规律，以期为紫脉龙韵苦茶鲜叶的分级采摘、分级加工及功能成分提取原料的选择提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦茶：广西南亚热带农业科学研究所茶树资源圃选育的品种“紫脉龙韵”，采摘其鲜叶（2022年3月30日）、花与果实（2022年10月20日）。

儿茶素（catechin，C）、表儿茶素（epicatechin，EC）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、没食子儿茶素（gallocatechin，GC）、儿茶素没食子酸酯（catechin gallate，CG）：北京北纳创联生物技术研究院；咖啡碱（caffeine，CAF）、可可碱（theobromine，TB）、茶碱（the⁃ophylline，TP）、1，3，7⁃三甲基尿酸（1，3，7⁃trimethyluric acid，TMUA）：成都植标化纯生物技术有限公司；苦茶碱（theacrine，TCR）：上海麦克林生化科技有限公司；总黄酮试剂盒、可溶性糖试剂盒、花青素试剂盒、蛋白质试剂盒：苏州格锐思生物科技有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、冰醋酸（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

6CTH 型烘干机：浙江上洋机械有限公司；XM⁃P30H 超声波清洗机：小美超声仪器（昆山）有限公司；DW⁃86L388J 超低温冰箱：青岛海尔特种电器有限公司；ME203E 万分之一电子精密天平：梅特勒⁃托利多国际贸易（上海）有限公司；UltiMate 3000 高效液相色谱仪：赛默飞世尔科技有限公司；BlueStar B 紫外可见分光光度计：莱伯泰科有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备

将不同嫩度鲜叶与不同部位（芽叶、茎、花、果皮）分别置于120 ℃烘箱烘20 min 后，再在70 ℃烘箱烘至足干，干样放入粉碎机粉碎，过60 目筛，置于-20 ℃冰箱储存，用于主要滋味品质成分的测定。

1.3.2 常规生化成分的测定

茶多酚及游离氨基酸含量的测定分别按照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》、GB/T 8314—2013《茶游离氨基酸总量的测定》的方法进行测定；蛋白质、可溶性糖、总黄酮、花青素含量测定的具体操作步骤根据相应试剂盒说明书进行。

1.3.3 儿茶素类、嘌呤生物碱组分及含量的测定

1.3.3.1 样品提取方法

参考刘庆帅等[17]的方法，分别称取1.3.1 制备的样品0.1 g（精确到0.000 1 g）于15 mL 离心管中，加入10 mL 70% 甲醇溶液，40 ℃下超声30 min，期间每隔5 min 上下摇匀5 次，将提取液在4 ℃冰箱静置2 h 后取上清液过0.22µm 有机膜，加入液相瓶中待测。

1.3.3.2 色谱分析条件

参考吴世玲[18]的方法，色谱条件：UltiMate 3000 高效液相色谱仪；AcciaimTM120 C18 Column（4.6 mm×250 mm，5µm）柱；流速0.5 mL/min；柱温35 ℃；检测波长280 nm；流动相[A 相：水∶乙腈∶乙酸= 96.5∶3∶0.5（体积比）；B 相：水∶乙腈∶乙酸= 69.5∶30∶0.5（体积比）]。

1.4 数据处理

数据以平均值±标准差表示，采用Statistics SPSS 26 软件进行单因素方差与主成分分析（principal com⁃ponent analysis，PCA），采用Origin 2021 软件进行相关性分析，利用联川生物平台（https：//www.omicstudio.cn/home）进行聚类分析以及数据归一化处理后绘制高级热力图。

2 结果与分析

2.1 不同嫩度鲜叶主要滋味品质成分单因素方差分析

可溶性糖、茶多酚、氨基酸、生物碱、儿茶素等滋味物质含量随茶树品种、鲜叶嫩度及部位的不同而不同[19]。不同嫩度“紫脉龙韵”苦茶鲜叶（图1）主要滋味品质成分单因素方差分析结果如表1所示。

表1 不同嫩度鲜叶主要滋味品质成分分析Table 1 Main taste quality ingredients in fresh leaves with different tenderness

图1 不同嫩度苦茶鲜叶Fig.1 Fresh leaves of kucha with different tenderness

可溶性糖是茶汤甜味的主要成分，能缓解茶汤滋味的苦涩味，增加茶汤的厚味和协调性[20]。由表1 可知，可溶性糖含量随着鲜叶嫩度的降低先升高后降低，一芽三叶中可溶性糖含量最高（211.92 mg/g）。蛋白质对茶汤保持清亮起重要作用，在茶汤中呈胶体状态。蛋白质含量随着鲜叶嫩度的降低先升高后降低，一芽二叶中蛋白质含量最高（11.45 mg/g），一芽三叶至五叶中蛋白质含量差异不显著（P＞0.05）。游离氨基酸是以鲜味为主的物质[21]，其含量随着鲜叶嫩度的降低而降低，与Zhang 等[22]研究结果一致。一芽一叶中游离氨基酸含量最高（48.05 mg/g），与一芽二叶含量差异不显著（P＞0.05），一芽三叶与一芽四叶含量差异同样不显著（P＞0.05）。茶多酚是茶汤滋味浓度和呈涩味的主体成分[19]，其含量随着鲜叶嫩度的降低先升高后降低，一芽一叶与一芽二叶中茶多酚含量差异不显著（P＞0.05）。花青素与黄酮类物质是茶叶苦涩味的主要影响物质[2，23]，两者含量呈波动性变化，在一芽四叶含量均较高。

儿茶素类成分是主要的多酚类物质，约占茶多酚含量的75%～80%，根据分子结构分为酯型儿茶素和非酯型儿茶素，影响茶叶的苦味、涩味[24]。非酯型儿茶素苦涩味较弱，先苦后甘，收敛性较弱，爽口。酯型儿茶素苦涩味较强，收敛性强，尤其是EGCG，对茶叶的苦涩起决定性的作用[2]。一般儿茶素组分构成以酯型儿茶素为主，EGCG 和ECG 是主要的儿茶素类成分。不同嫩度“紫脉龙韵”苦茶鲜叶儿茶素类物质以酯型儿茶素为主，随着鲜叶嫩度的降低，酯型儿茶素、EGC 与EGCG 含量逐渐降低。不同嫩度鲜叶间，EGC 含量差异显著，其他儿茶素成分含量呈波动性变化。一芽二叶中非酯型儿茶素与儿茶素含量最高，且从一芽二叶至一芽五叶，两者含量均降低，一芽四叶与一芽五叶之间含量差异不显著。一芽一叶与一芽二叶中儿茶素总含量较高，且含量差异不显著（P＞0.05），一芽三叶与一芽四叶中儿茶素总含量差异不显著（P＞0.05），一芽五叶中含量最低。嘌呤生物碱是茶树体内主要次级代谢产物，主要包括CAF、TB、TP、TCR 及TMUA[25]，是茶叶中主要的苦味物质，其组分构成及含量影响茶叶品质的优劣及适制性[26]。在鲜叶中未检测到TP，不同嫩度鲜叶间，TB、CAF 随着鲜叶嫩度的降低而降低，不同鲜叶间含量差异显著。TCR 含量相对稳定，一芽一叶、一芽二叶、一芽三叶差异不显著，其中，一芽三叶中含量最高（12.04 mg/g）。嘌呤生物碱总含量随着鲜叶嫩度的降低而降低，一芽三叶与一芽四叶中含量差异不显著（P＞0.05）。

2.2 不同嫩度鲜叶主要滋味品质成分聚类分析

为了直观地展示22 种主要滋味物质在不同嫩度鲜叶中含量变化趋势，采用聚类分析（hierarchical clus⁃ter analysis ，HCA）[27]对成分指标进行高级热图分析，结果见图2。

图2 不同嫩度苦茶鲜叶主要滋味品质成分分布热图Fig.2 Heat map of distribution of taste quality ingredients in fresh leaves of Kucha with different tenderness

由图2 可知，一芽一叶中游离氨基酸与TB 含量较高，TMUA、EC、CG 含量较低。一芽二叶中非酯型儿茶素、蛋白质、GC 与C 含量较高。一芽三叶中TCR 与可溶性糖含量较高，花青素含量最低，一芽四叶中花青素含量最高，一芽五叶中总黄酮含量最高，其他成分指标含量较低。因此，可以将5 个嫩度鲜叶分为二大类，一芽一叶与一芽二叶属于第一类，一芽三叶、一芽四叶、一芽五叶属于第二类，分类结果较合理。Huang等[28]研究表明嫩叶中生化成分含量较高，成熟叶中含量较少，与本研究结果相似。研究结果可用于指导“紫脉龙韵”苦茶鲜叶的分级采摘。

2.3 不同嫩度鲜叶主要滋味品质成分相关性分析

茶叶滋味品质指标之间并非独立，而是具有一定相关性，相关性分析是衡量变量因素的相关密切程度。对不同嫩度鲜叶主要滋味品质成分进行相关性分析，可明确各指标间的关系，为“紫脉龙韵”苦茶滋味品质特征的形成提供理论依据。不同嫩度鲜叶主要滋味物质的Pearson 相关性分析结果如图3所示。

图3 不同嫩度鲜叶主要滋味品质成分间的相关性Fig.3 Correlations of main taste quality ingredients in fresh leaves with different tenderness

由图3 可知，不同嫩度鲜叶之间，酯型儿茶素、儿茶素、嘌呤生物碱含量均与游离氨基酸、CAF、EGC、EGCG、GCG、ECG 呈极显著正相关（P＜0.01），且在这些成分中，游离氨基酸与茶多酚、CAF、EGCG、ECG 含量呈极显著正相关（P＜0.01），CAF 与EGC、茶多酚与ECG、儿茶素与嘌呤生物碱含量均互呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为0.99、0.96 和0.98。GC 与C 含量呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数为0.99。蛋白质与GCG 呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数为0.97。TB 与EGC 含量呈极显著正相关（P＜0.01），而与TMUA 含量呈极显著负相关（P＜0.01），相关系数分别为0.96 和⁃0.99。由此说明，各成分指标之间存在不同程度的相关性，品质指标之间的信息存在重叠。

2.4 不同嫩度鲜叶主要滋味物质主成分分析（PCA）

不同品质指标存在不同程度差异，各品质指标间也存在不同程度相关性，使得滋味品质评价结果会因信息重叠而不明确，通过单一指标大小来评价不同鲜叶滋味品质差异并不客观。主成分分析（PCA）能有效减少变量的数量，发掘出有代表性的主成分因子，故采取该分析方法对滋味物质作进一步探究，结果如表2所示。

表2 主成分载荷矩阵、贡献率和累积贡献率Table 2 Factor loading，contribution，and cumulative propor⁃tion obtained by PCA

由表2 可知，前3 个成分累积贡献率达96.546%，基本综合原始数据的信息，说明这3 个成分能反映22 个指标的绝大部分信息，故选取前3 个特征值进行主成分分析。主成分1（PC1）的特征值为14.605，方差贡献率为66.387%，贡献较大的为蛋白质、游离氨基酸、茶多酚、TB、TMUA、CAF、EGC、EGCG、GCG、ECG、酯型儿茶素、儿茶素及嘌呤生物碱，其中以EGC、EGCG 与酯型儿茶素的贡献最大，载荷值均为0.997。主成分2（PC2）的特征值为4.875，方差贡献率为22.157%，贡献较大的为GC、C，载荷值分别为0.841、0.891。主成分3（PC3）的特征值为1.760，方差贡献率为8.002%，贡献最大为花青素，载荷值为0.643。PC1和PC2 累积贡献率达88.544%，反映了“紫脉龙韵”鲜叶品质的主要信息，因此，PC1 和PC2 的代表性成分指标对鲜叶呈味品质的影响起主要作用，结合这些代表性成分在不同嫩度鲜叶中的差异程度（表1），推测蛋白质、游离氨基酸、茶多酚、TB、CAF、EGC、EGCG、GCG、ECG、GC 及C 是不同嫩度鲜叶间的关键差异成分。

以3 个主成分对应的方差相对贡献率为权重，将不同嫩度鲜叶主成分得分和相应权重进行线性加权求和，计算不同嫩度鲜叶的综合评价得分，得分越高，表示该嫩度鲜叶相对滋味品质越好。各主成分下的得分、综合得分及综合排名结果见表3。

由表3 可知，按综合排序从高到低依次为一芽二叶＞一芽一叶＞一芽三叶＞一芽四叶＞一芽五叶。由此可见，一芽一叶与一芽二叶滋味品质较佳，更适合用于高档“紫脉龙韵”苦茶茶叶的制备。研究结果可为不同档次“紫脉龙韵”苦茶茶叶加工原料的选择提供参考。

2.5 不同部位嘌呤生物碱含量差异分析

不同部位“紫脉龙韵”苦茶嘌呤生物碱含量差异见图4。

图4 不同部位嘌呤生物碱组分与含量Fig.4 Composition and content of purine alkaloids in different parts of tea plants

如图4所示，TB 含量中单芽最高（6.17 mg/g），随着叶位增加，TB 含量逐渐降低，第三叶、第四叶、第五叶与茎中TB 含量差异不显著，花与果皮中未检测到。不同部位中TMUA 含量均较低，且含量变化不大。从单芽到第四叶，TCR 含量逐渐升高，最高达17.12 mg/g，且不同部位芽叶中TCR 含量差异显著（P＜0.05）。单芽、茎、花及果皮4 个部位中TCR 含量差异不显著，含量在5.16～6.22 mg/g。第一叶中CAF 含量最高（34.15 mg/g），从第一叶开始，随着叶位增加，咖啡碱含量呈现逐渐降低的趋势，且不同叶位间咖啡碱含量差异显著（P＜0.05），与陈林等[29]研究结果基本一致。花与果皮部位中咖啡碱含量极低，特别是果皮部位，几乎检测不到咖啡碱。不同叶位间嘌呤生物碱总含量变化情况与咖啡碱相同。总体来说，苦茶碱与咖啡碱是“紫脉龙韵”苦茶主要嘌呤生物碱，且不同部位两者含量差异较大，茎、花与果皮中嘌呤生物碱组分含量相对较低。

3 讨论与结论

茶多酚、生物碱、儿茶素、花青素等成分含量、组成比例的不同是茶汤滋味强度差异形成的重要因素。本研究通过单因素方差分析研究“紫脉龙韵”苦茶不同嫩度鲜叶中主要滋味品质成分含量，发现随着鲜叶嫩度的降低，可溶性糖、蛋白质与茶多酚含量先升高后降低，游离氨基酸、EGC、EGCG、酯型儿茶素与嘌呤生物碱总含量降低，总黄酮及花青素含量呈波动性变化。相关性分析结果表明，各滋味品质成分之间存在一定的相关性。聚类分析把不同嫩度鲜叶分为一芽一叶、一芽二叶和一芽三叶、一芽四叶、一芽五叶两类，分类结果可用于指导“紫脉龙韵”苦茶鲜叶的分级采摘及加工。主成分分析得到3 个主成分，累积贡献率达96.546%，结合单因素分析，推测蛋白质、游离氨基酸、茶多酚、TB、CAF、EGC、EGCG、GCG、ECG、GC 及C 是不同嫩度鲜叶的关键差异成分。由不同嫩度鲜叶的综合评价得分可知一芽一叶与一芽二叶滋味品质较佳，研究结果可为不同档次“紫脉龙韵”苦茶茶叶加工原料的选择提供参考。

茶叶具有独特的营养价值和保健功能，但其利用率极低，除采其嫩芽制作成商品茶外，茶树其他部位（老叶、花及果皮）往往被废弃，造成了资源极大浪费。特别是特异茶树品种，其老叶、花及果皮往往仍具有含量较高的功能成分。如果能将这些部位用于开发日用品、功能型饮品等深加工茶叶产品，可达到变废为宝及提升茶产业经济价值的作用。苦茶中苦茶碱含量相对较高，具有潜在的药用价值。本研究通过检测不同部位嘌呤生物碱含量，发现低叶位（嫩叶）中可可碱与咖啡碱含量较高，高叶位（成熟叶）具有高苦茶碱含量与低咖啡碱含量的特征，且果皮不含或仅含有极少量咖啡碱。由此可见，不同部位“紫脉龙韵”苦茶嘌呤生物碱组分分布及含量差异较大，可以根据需要选择相应的部位作为原料，进行不同功能性产品的深加工，使“紫脉龙韵”苦茶除了嫩叶以外的其他部位得到充分利用，大幅度提升该品种的经济价值。