湖南特色刺葡萄果皮中优势次生代谢物质分析

朱羿博，何雪，李杰，陈彦彤，刘昆玉，杨国顺，谭君

（湖南农业大学园艺学院，湖南长沙 410128）

刺葡萄（VitisdavidiiFoex）是葡萄科葡萄属植物，木质藤本，可做药用，因径和叶柄部分带有皮刺，被称为‘刺葡萄’，主要分布在中国的湖南、广西和福建等地，生长于海拔600～1 800 m 的山坡、沟谷林或灌丛中。刺葡萄作为中国特有野生葡萄种质资源之一，果皮厚实、来源广泛、价格低廉，是非常好的加工原料，广泛用于刺葡萄酒、刺葡萄籽油和刺葡萄果汁等的制备[1⁃2]，其加工产品中发现有一定的生物活性功能，包括降血脂、抗氧化和消炎等功效[3]。由于刺葡萄果实和其加工产品中带有独特的香气，近年来对刺葡萄香气特征进行了大量研究[4]，同时刺葡萄还是耐高温高湿、抗黑痘病、炭疽病、白腐病的宝贵资源和抗真菌病害的重要砧木育种材料[5]。

葡萄果皮是葡萄的重要组成部分之一，葡萄中的次生代谢物质主要集中在果皮和籽当中[6]。葡萄皮提取物的研究一直都是人们关注的热点，近年来大量研究表明葡萄提取物具有抗氧化、消炎、减脂和对肠道细菌的积极影响等多种功效[7⁃10]。葡萄皮提取物在功能食品行业占据着非常重要的市场地位，其功能成分丰富，是功能食品和药物的重要来源[11]。不同的葡萄品种，其次生代谢产物的种类和含量有较大差异，并受到气候、地理因素和成熟阶段等因素的影响[12⁃14]。中国野生葡萄的果皮被发现含有丰富的次生代谢产物[15]，且对其次生代谢产物的积累模式也都进行了相关研究[16]，但是对于刺葡萄果皮的次生代谢产物及其积累模式的研究报道很少。刺葡萄皮作为加工过程中的废料，是葡萄多酚的重要来源[17]，同时刺葡萄皮已经被证实富含花色苷，是一种有巨大潜力的色素资源，可作为提取锦葵素的重要原料[18]。刺葡萄皮中还含有大量的白藜芦醇，是酿酒葡萄‘赤霞珠’的两倍[19]，因此刺葡萄皮在食品加工行业中有巨大的开发潜力。

超高效液相色谱质谱联用（ultra⁃high performance liquid chromatography⁃tandem mass spectrometry，UPLC⁃MS/MS）技术是一种高效快速的检测方法，与传统检测方法相比，有高效、快速、灵敏、高选择性和高通量等优点，已被广泛应用于植物差异性、植物代谢物反应、植物营养品质等多方面的研究中，陈秀萍等[20]基于UPLC⁃MS/MS 方法对枇杷不同组织萜类代谢物进行鉴定，罗利利等[21]通过UPLC⁃MS/MS 方法比较蒲公英不同部位代谢物的差异并与其抑菌作用作比较。因此通过该方法可以更精准快速地分析葡萄果皮中的次生代谢物质组成。

本研究对刺葡萄果皮中的次生代谢产物进行广泛靶向代谢组研究，以代表性葡萄品种‘夏黑’和‘阳光玫瑰’为对照，挖掘‘湘刺1 号’、‘湘刺2 号’和‘湘刺4号’3 种湖南特色刺葡萄品种的果皮中优势次生代谢产物，以期为湖南省刺葡萄种质资源的利用和评价提供科学的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘湘刺1 号’、‘湘刺2 号’、‘湘刺4 号’、‘夏黑’、‘阳光玫瑰’葡萄：湖南省怀化市中方县农业局刺葡萄基地。所有葡萄均接受相同的管理，在生理成熟时采摘。刺葡萄的成熟果实的照片如图1所示。果皮从浆果中剥离后，立即用液氮冷冻，并保存在-80 ℃冰箱中备用。

图1 刺葡萄成熟果实Fig.1 Mature fruits of spine grape

甲醇、乙腈（均为色谱纯）：德国Merck 公司；针筒式微孔滤头（0.22µm）：泰安泰美生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Nexera X2 超高效液相色谱仪：日本SHIMADZU公司；4500 QTRAP 串联质谱仪：美国Applied Biosys⁃tems 公司；Scientz⁃100F 冷冻干燥机：宁波新芝冻干设备股份有限公司；MM 400 研磨仪：德国Retsch 公司；MS105 型电子分析天平：瑞士Mettler⁃Toledo 公司。

1.3 方法

1.3.1 试验流程

葡萄皮样品放置于冻干机中真空冷冻干燥，利用研磨仪研磨（30 Hz，1.5 min）。称取100 mg 的粉末溶解于1.2 mL 70% 甲醇提取液中，每30 min 涡旋振荡一次，每次持续30 s，共涡旋振荡6 次，样本置于4 ℃冰箱过夜；12 000 r/min 离心10 min 后，吸取上清液，用0.22 µm 针筒式微孔滤头过滤样品，并保存于进样瓶中，用于UPLC⁃MS/MS 分析。

1.3.2 色谱质谱条件

色谱柱：Agilent SB⁃C18（1.8µm，2.1 mm×100 mm）；流动相：A 相为超纯水（加入0.1% 的甲酸），B 相为乙腈（加入0.1% 的甲酸）；洗脱梯度：0.00 min B 相比例为5%，9.00 min 内B 相比例线性增加到95%，并维持在95% 1 min，10.00～11.10 min，B 相比例降为5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱温40 ℃；进样量4µL。

质谱条件：电子轰击离子源，涡轮喷雾；离子源温度550 ℃；离子喷雾电压5 500 V（正离子模式）/-4 500 V（负离子模式）；离子源气体I、气体II 和帘气分别设置为0.34、0.41、0.17 MPa；多反应监测模式（multi⁃reac⁃tion monitoring mode，MRM）。

1.4 数据处理

代谢物的定性基于迈维自建数据库，去除同位素、碎片离子和重复离子信号，根据二级谱信息进行物质定性。采用SPSS 26.0 对数据进行统计分析，采用Ori⁃gin 2022 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同品种葡萄果皮中次生代谢产物的化学组成

试验选择3 个刺葡萄品种‘湘刺1 号’（XC1H）、‘湘刺2 号’（XC2H）、‘湘刺4 号’（XC4H）和2 个鲜食葡萄品种‘夏黑’（XH）、‘阳光玫瑰’（YGMG）的果皮进行广泛靶向代谢组研究。基于UPLC⁃MS/MS 技术，通过图谱和数据库比对，在5 个品种的葡萄果皮中共检测到737 个次生代谢物质，包括类黄酮、酚酸、有机酸、萜类等九大类化合物。不同品种的葡萄果皮中次生代谢产物的韦恩图与百分占比图如图2所示。

图2 不同品种的葡萄果皮中次生代谢产物的韦恩图与百分占比图Fig.2 Venn diagramand composition of secondary metabolites in peels of different grape varieties

由图2 可知，‘湘刺1 号’检测出711 个物质，‘湘刺2 号’检出666 个物质，‘湘刺4 号’检出710 个物质，‘夏黑’葡萄检出692 个物质，‘阳光玫瑰’葡萄检出622 个物质。不同品种的共有化合物为564 个（图2a）。在这些次生代谢产物中，类黄酮物质大约占18.4%，酚酸类物质约占15.8%，有机酸和萜类各占9.7% 和2.9%。由此可以看出，5 种不同品种的葡萄果皮中，次生代谢产物的组成无明显差异，不同类别的次生代谢产物的物质组成比例相似。

2.2 不同品种葡萄果皮中的主要差异次生代谢产物

对不同品种葡萄果皮中的次生代谢产物进行主成分分析（principal component analysis，PCA），结果如图3所示。

图3 不同葡萄果皮中次生代谢产物的PCA 得分Fig.3 PCA score plot of secondary metabolites in peels of differ⁃ent grape varieties

由图3 可知，在主成分1 和2 中分别解释了37.3%和19.4%的物质差异，3 个质控样本均在中心点位置且高度重合，说明本次检测的数据可靠。所有样本在PCA 图中被分成了4 个区域，刺葡萄样品均位于PC1轴中的正半轴，而‘夏黑’和‘阳光玫瑰’样品位于负半轴，说明刺葡萄与两个鲜食葡萄品种（‘夏黑’和‘阳光玫瑰’）的果皮中次生代谢产物存在明显差异，而‘湘刺1 号’和‘湘刺2 号’的果皮中次生代谢产物比较接近。

通过比对代谢组学数据库的物质信息发现刺葡萄果皮样本中共检出136 个类黄酮物质、37 个萜类或鞣质、109 个酚酸、72 个有机酸、47 个生物碱、15 个木质素或香豆素，主要的特色次生代谢产物为类黄酮和酚酸。对所有检出物质的信号进行分层聚类分析，结果如图4所示。

图4 不同品种葡萄果皮样本中的167 个差异物质、类黄酮物质和酚酸类物质的聚类热图Fig.4 Heatmap of 167 differential metabolites，flavonoids，and phenolic acids in the peel samples of different grape varieties

由图4 可知，不同葡萄品种的样本中差异明显的有167 个化合物，红葡萄（‘湘刺1 号’、‘湘刺4 号’和‘夏黑’）的果皮中类黄酮物质含量多于白葡萄（‘湘刺2 号’和‘阳光玫瑰’）；在‘湘刺4 号’果皮中，类黄酮物质较其他品种更为丰富（图4b）；而‘湘刺2 号’和‘湘刺1 号’的果皮中，酚酸类物质含量较高（图4c）。

2.3 不同品种刺葡萄果皮中的特色次生代谢产物分析

对不同品种葡萄果皮的次生代谢产物进行深入分析，挖掘刺葡萄的特色次生代谢产物分子，结果如图5所示。

图5 不同品种葡萄的果皮中差异类黄酮化合物、萜类或鞣质类物质和花色苷类物质相对含量百分比Fig.5 Relative content of differential flavonoids，terpenoids or tannins，and anthocyanins in the peels of different grape varieties

由图5 可知，‘湘刺2 号’和‘湘刺4 号’的果皮含有较多的原花青素B2、原花青素C1 和原花青素B4；‘湘刺1 号’和‘湘刺4 号’的果皮中富含芍药花素⁃3⁃O⁃芸香糖苷、锦葵色素⁃3⁃O⁃（6′′⁃O⁃乙酰）葡萄糖苷⁃5⁃O⁃葡萄糖苷、矢车菊素⁃3⁃O⁃（2′′⁃O⁃葡萄糖基）葡萄糖苷和飞燕草素⁃3，5⁃O⁃二⁃O⁃葡萄糖苷；‘湘刺4 号’的黄酮类物质较为突出；‘湘刺1 号’则含有较多的柠檬素⁃3⁃O⁃葡萄糖苷、扁蓄苷（广寄生苷）和槲皮素⁃3⁃O⁃阿拉伯糖苷（番石榴苷）、槲皮素⁃3⁃O⁃桑布双糖苷、丁香亭⁃3⁃O⁃（6′′⁃乙酰）葡萄糖苷、芍药花素⁃3⁃O⁃芸香糖苷和锦葵色素⁃3⁃O⁃（6′′⁃O⁃乙酰）葡萄糖苷⁃5⁃O⁃葡萄糖苷。

此外，刺葡萄果皮中含有31 个特有的次生代谢产物，其LC⁃MS 定性结果如表1所示。

表1 刺葡萄果皮中特有次生代谢产物的LC⁃MS 定性结果Table 1 LC⁃MS results for unique secondary metabolites in Vitis davidii peels

由表1 可知，刺葡萄果皮特有次生代谢产物中包括10 个类黄酮物质、4 个萜类或鞣质类物质，其中对香豆酰阿魏酰酒石酸和紫丁香苷仅在‘湘刺1 号’中检测出。

3 讨论与结论

本试验利用UPLC⁃MS/MS 广泛靶向代谢组学技术，对不同品种葡萄果皮中的次生代谢产物进行组学分析，筛选出湖南省3 个刺葡萄品种果皮中的特色次生代谢产物。结果表明，不同刺葡萄品种中，‘湘刺4号’果皮中的类黄酮物质最丰富，在功能食品上具有较高的利用价值和开发潜力；‘湘刺2 号’含有丰富的原花青素；对香豆酰阿魏酰酒石酸和紫丁香苷仅在‘湘刺1 号’中检出，可作为其特征物质。但由于本次的葡萄品种数量较少，后续研究中还需进一步收集更多的葡萄品种，并进行多角度的数据验证。

国内外相关研究表明，葡萄中的优势次生代谢产物为类黄酮和原花青素[22]。类黄酮有较强的功能特性[23⁃25]，对葡萄和葡萄酒的品质具有决定性作用，并保护葡萄免受外界伤害[26]；原花青素以B 型结构为主，主要集中在葡萄的果皮和种子中[27]。低聚合度的原花青苷具有较强的抗氧化活性[8]，在食品和制药工业有非常大的发展潜力且对于刺葡萄酒的特色风味有着重要贡献[28⁃30]。本试验结果与上述文献报道结果相吻合，刺葡萄中所含有的丰富的类黄酮和原花青素类物质具有较多的生理活性功能，可为本省刺葡萄深加工产业的高附加值产品开发提供理论依据。