circ-0030042通过miR-145/PTEN轴调控对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及迁移的影响

张毓姣 郭智辉 孟艳斌 高亚丽 段鹏 郝振明

[摘要]目的：探讨circ-0030042与人第10号染色体缺失的磷酸酶（Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）的相互作用關系，并分析其在增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）患者中对成纤维细胞增殖与迁移的影响及作用机制。方法：通过circRNA序列和定量聚合酶链反应（PCR技术）检测正常皮肤成纤维细胞（NSFBs）和增生性瘢痕患者成纤维细胞（HSFBs）中circ-0030042的表达。用CCK8检测法检测转染48 h后的HSFBs细胞增殖情况。利用stubRFP-sensGFP-LC3基因转染、流式细胞仪及电子显微镜观察circ-0030042对miR-145/PTEN轴调控VEGF水平的表达。利用生物信息学分析、RNA免疫沉淀、免疫荧光检测等方法，揭示circ-0030042介导HS患者成纤维细胞增殖与迁移的作用机制。结果：circ-0030042在增生性瘢痕中显著上调，过表达时作为VEGF海绵抑制miR-145诱导的成纤维细胞，维持体内稳定性。此外，circ-0030042通过海绵化VEGF水平并阻断其miR-145捕获转录因子（FOXO1）mRNA来影响自噬，而circ-0030042诱导FOXO1的抑制被VEGF水平过表达或circ-0030042结合减少所抵消。过表达circ-0030042对成纤维细胞的增殖抑制与VEGF表达的抑制作用被过表达miR-145部分抵消。结论：干扰circ-0030042通过靶向下调miR-145/PTEN轴进而抑制HSFBs细胞的增殖与迁移，进一步诱导恶性细胞凋亡。

[关键词]circ-0030042；miR-145/PTEN轴；增生性瘢痕；成纤维细胞；细胞迁移/增殖

[中图分类号]R619+.6    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2024）01-0049-05

Effect of circ-0030042 on Proliferation and Migration of Fibroblasts in Hypertrophic Scar by Regulation of miR-145/PTEN Axis

ZHANG Yujiao1，GUO Zhihui2，MENG Yanbin1，GAO Yali3，DUAN Peng2，HAO Zhenming1

[1.Department of Burn Ⅱ， 2.Department of Burn Ⅰ， 3.Department of Dermatology， General Hospital of Taiyuan Iron and Steel （Group） Co.，Ltd.，Taiyuan 030000，Shanxi，China]

Abstract： Objective  To investigate the interaction relationship between circ-0030042 and Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten （ PTEN ）， and to analyze its effect and mechanism on fibroblast proliferation and migration in patients with proliferative scar （HS）. Methods  The expression of circ-0030042 in normal skin fibroblasts （NSFBs） and fibroblasts （HSFBs） of patients with proliferative scars was detected by circRNA sequence and quantitative polymerase chain reaction （PCR）.The proliferation of HSFBs cells after transfection 48 h was detected by CCK8 assay. The expression of circ-0030042 on the miR-145/PTEN axis to regulate VEGF levels was observed by stubRFP-sensGFP-LC3 gene transfection， flow cytometry and electron microscopy. Bioinformatics analysis， RNA immunoprecipitation， immunofluorescence and other methods were used to reveal the mechanism of CIRC-0030042 mediating fibroblast proliferation and migration in HS patients. Results  Circ-0030042 is significantly up-regulated in hypertrophic scars. Overexpression of circ-0030042 acts as a VEGF sponge to inhibit miR-145-induced fibroblasts and maintain stability in vivo. In addition， circ-0030042 affects autophagy by spongeizing VEGF levels and blocking its miR-145-capturing transcription factor （FOXO1） mRNA， while circ-0030042-induced inhibition of FOXO1 is offset by overexpression of VEGF levels or decreased binding of circ-0030042. The proliferation inhibition of fibroblasts and VEGF expression by overexpression circ-0030042 were partially offset by overexpression miR-145. Conclusion  Interference with circ-0030042 inhibits the proliferation and migration of HSFBs cells by targeting down-regulating the miR-145/PTEN axis， and further induces apoptosis in malignant cells.

Key words： circ-0030042; miR-145/PTEN shaft; hypertrophic scarring; fibroblast; cell migration/proliferation

增生性瘢痕（HS）主要特點为大量的胶原沉积和成纤维细胞的增生。目前，手术切除、药物和激光等是临床治疗的主要手段，但因瘢痕的复发率较高，所以研究其病因和寻找有效治疗措施具有重要意义[1-2]。miRNA是一种以自身功能为基础的微型非编码RNA，参与了纤维细胞的增殖和纤维化等过程，它可以对目标基因进行负向调节[3]。有研究表明[4]，miR-145在HS皮肤组织中的水平是正常人的3倍。已有的研究发现PTEN对人瘢痕成纤维细胞HSFb及HS组织的表达有明显的下调[5]。通过基因综合表达数据库发现circ-0030042尚未被深入研究，目前只发现circ-0030042对动脉粥样硬化具有保护作用，能有效抑制血管内膜纤维化，但其在HS中的作用机制尚不清楚[6]。然而，circ-0030042是否能调控miR-145/PTEN对HS产生影响尚不清楚。基于此，本研究旨在探讨circ-0030042通过调控miR-145/PTEN轴对瘢痕成纤维细胞的作用，阐明circ-0030042在HS中发挥的作用及具体作用机制，为HS治疗提供有效靶点。

1  资料和方法

1.1 试验材料：正常皮肤成纤维细胞（NSFBs）和增生性瘢痕患者成纤维细胞（HSFBs），SYBR Premix Ex TaqⅡ染料法荧光定量PCR试剂盒（上海古朵生物科技有限公司），新生牛、胎牛血清（杭州天杭生物科技股份有限公司），Opti-MEM、RPMI 1 640培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司），Lipofectamin 2 000脂质体转染试剂（Invitrogen公司）。β-actin（鼠抗）、HRP标记的抗鼠、抗兔二抗[为翌圣生物科技（上海）股份有限公司]，C-MYC、CCND1、p-Akt抗体（Invitrogen公司），JNK1（上海恒斐生物科技有限公司）。10%正常羊封闭血清（北京诺博莱德科技有限公司），免疫荧光染色二抗稀释液[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。Ly294002（P13K/AKT阻断剂）（Cayman Chemical公司产品）。

1.2 方法

1.2.1 标本收集：收集笔者医院HS患者的病理组织与邻近正常皮肤组织各25例，HS患者经临床病理诊断确诊。将皮肤样品储存于液氮中留存备用。所有患者均对本研究内容知情同意，并且签署知情同意书。该试验方案由医院伦理委员会批准。

1.2.2 细胞培养：取HSFBs和NSFBs细胞系进行常规复苏后，取两组适量细胞，用含10%的胎牛血清培养基在恒温箱中进行传代培养及计数，传代培养结束分别用RPMI 1 640和37℃的CO2细胞培养箱中进行培养。在转染1 d后，将该细胞进行传代，当其融合程度达到40%时，再进行转染。HSFBs细胞按处理方式分成下列类型：①空白组：细胞未做处理；②hsa-NC组：细胞转染hsaRNA NC；③hsa-circ-0030042组：细胞转染hsa-circ-0030042；④hsa-circ-0030042+anti-NC组：细胞共同转染hsa-circ-0030042和miRNA inhibitor阴性对照（anti-NC）；⑤hsa-circ-0030042+anti-miR-145组：细胞共同转染hsaRNA circ-0030042（hsa-circ-0030042）和miR-145 inhibitor（anti-miR-145）；⑥miR-NC组：细胞转染miRNA mimics阴性对照（miR-NC）；⑦miR-145组：细胞转染miR-145；⑧miR-145+VEGF组：细胞共同转染miR-145和VEGF空载体；⑨miR-145+信号传导血管内皮生长因子（VEGF）重组过表达质粒（pcDNA-VEGF）组：细胞共同转染miR-145 mimics和pcDNA-VEGF。用Li-pofectamine 3 000试剂进行细胞转染，48 h后进行下一步试验。

1.2.3 qRT-PCR检测：按照GREENspin组织/cRNA快速萃取试剂盒的操作程序，对每一组进行了细胞RNA的提取[7]。通过使用Takara RNA聚合酶链式反应Kit（AMY），进行反转录。用RT试剂盒对RNA进行反向转录，用cDNA 1链作为模板进行PCR检测。聚合酶链反应产物琼脂糖凝胶电泳和DNA吸光度分析；该显色条带图像分析系统（Alpha Imager 2 000）对其积分吸光度进行检测，并且用该内参β-actin条带的比率作为mRNA的表达水平参量。miR-145在HSFBs和NSFBs细胞中的表达，用U6 mRNA作为内参量进行检测。GAPDH为circ-0030042及VEGF的内参mRNA，引物序列：miR-145正向：5＇-TCCATCCTGCAGAAGAAGCC-3＇，反向：5＇-TGCTTTGAATCCAAAAACCTTACT-3＇；circ-0030042正向：5＇-TGGATGGAGATACATTGGATT-3＇；反向：5＇-ATTGAGCATCCACCAAGAcAC-3＇；VEGF mRNA正向：5＇-GC-ATTACGCTTAAGGCCTA-3＇，反向5＇-CAATGGGCACTCCGGGATCG-3＇。

1.2.4 双荧光素酶报告基因试验：将含miR-145序列的circ-0030042（circ-0030042-WT）及其突变序列（circ-0030042-MUT）、VEGF UTR（VEGF 3′UTR-WT）和其突变序列（VEGF 3′UTR-MUT）构建基因载体，再用miR-NC、miR-145共转染OVCAR-3细胞，48 h后进行荧光酶活性的测定[8]。

1.2.5 CCK8实验检测细胞增殖活性：取OVCAR-3对数生长周期的细胞进行调剂，使其浓度达到5×105/ml。用96孔板接种100 μl的细胞悬浮液，在37℃下用5% CO2培养皿中培养。在24、48和72 h后，添加CCK8 10 μl的溶液，再进行4 h的培养，用酶标仪测定45 nm的吸光度（OD）值[9]。

1.2.6 Western blot检测：采用RIPA热裂解溶液进行酶解，在4℃下，12 000 g的离子体进行15 min的离心，然后采用上清-BCA方法进行定量分析，将少量蛋白质用上样缓冲液制备成蛋白质，在95℃下加热，经SDS-PAGE电泳后转PVDF膜处理，PTEN、Akt.p-Akt、GAPDH一抗于4℃下经TBST处理[8]。TBST对未结合的一抗进行2 h的二次免疫培育，将未经连接的二抗用TBST洗涤，在暗室内用化学发光剂ECL将条带进行曝光和显像，用Image J软件测量各条带灰度，以GAPDH作为内参数并计算各蛋白相对表达量[10]。

1.3 统计学分析：采用SPSS 22.0统计软件分析数据，计量资料均以（x¯±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 敲减circ-0030042抑制HS细胞的增殖、迁移和侵袭：hsa-circ-0030042组与空白组、hsa-NC组相比，circ-0030042的相对表达水平显著下降（P＜0.05），表明hsaRNA-circ-0030042的基因转染效果良好。细胞功能实验结果显示，与空白组和hsa-NC组比较，hsa-circ-0030042组细胞培养在24 h、48 h、72 h后，其增殖活性明显降低（P＜0.05），且在24 h内，其迁移和侵袭的数目明显减少（P＜0.05）。见表1。

2.2 circ-0030042靶向miR-145：利用生物信息学网站Circinteractome，本文预测circ-0030042和miR-145具有结合位点（见图1）；双荧光素酶实验结果显示，与hsa-NC+circ-0030042-WT共转染组相比，miR-145+circ-0030042-WT共转染组的萤光素活性明显降低（P＜0.05），见图2；qRT-PCR结果显示hsa-circ-0030042组与空白对照组及hsa-NC组相比，miR-145在hsa-circ-0030042组中的相对表达水平明显增高（P＜0.05），见图3。提示通过靶向circ-0030042可以明显地降低HSFBs中miR-145的基因水平。

2.3 circ-0030042靶向miR-145調控HSFBs细胞的增殖、迁移和侵袭：与hsa-NC组相比，hsa-circ-0030042组在培养48、72 h后，细胞增殖活性均有显著下降（P＜0.05），而在24 h其细胞迁移与侵袭数目较hsa-NC组减少（P＜0.05）；与hsa-circ-0030042+anti-NC组比较，在48、72 h培养条件下，hsa-circ-0030042+anti-miR-145的细胞增殖活性均有显著提高（P＜0.05），其在24 h内的细胞转移和浸润数量明显增多（P＜0.05），见表2。

2.4 circ-0030042靶向miR-145调控VEGF的表达：本次试验利用TargetScan，发现miR-637与VEGF3' UTR存在结合位点（见图4）；双荧光素酶实验结果显示，与miR-NC+VEGF 3’UTR WT共转染组比较，miR-145+ VEGF 3' UTR WT共转染后，其荧光素酶活力显著下降（P＜0.05），表明miR-145可与VEGF的3'UTR靶向相互结合，见图5；RT-qPCR及Western blot分析表明hsa-circ-0030042+anti-miR-145组VEGF mRNA及蛋白质的相对表达率均显著高于hsa-circ-0030042+anti-NC的对照组，VEGF mRNA及蛋白质的相对表达率均有显著提高（P＜0.05），见表3、图6。

2.5 miR-145靶向VEGF调控HSFBs细胞的增殖、迁移和侵袭：Western blotting试验表明，miR-145组的VEGF mRNA及蛋白的表达比miR-NC组显著下降（P＜0.05）；miR-145+pcDNA-VEGF组细胞VEGF mRNA及蛋白表达含量显著高于miR-145+pcDNA组（P＜0.05），见图7、表4。

3  讨论

HS是由于人体受到创伤、炎症、烧伤、外伤或自发形成的一种过敏性病变，表现为大量的胶原、糖蛋白等在细胞外基质中堆积，胶原纤维的分布不均匀[11]。目前HS的发病率高达4%～16%，严重者不仅影响美观，还会导致组织、器官发生不同程度的功能障碍，甚至会造成残疾，对患者正常的生活与工作造成影响，给患者带来生理和精神上的损害[12]。目前，对HS的治疗方法并不理想。在瘢痕的形成中，成纤维细胞是影响移植的主要因素，因此，在瘢痕修复中，抑制其生长和分化对临床治疗瘢痕具有重要意义。既往大量研究表明，circRNA可较好抑制miR-145的作用，但circ-0030042在HS中对miR-145是否具有调控效用尚未有研究证实。

miRNA是一类长度约22 nt的非编码小分子RNA。它能够以完全或不完全互补的形式，识别并结合相关的靶基因，通过溶解或抑制靶基因的mRNA翻译过程，在转录后水平上调控基因和（或）蛋白的表达。miR-145已被证明可以在多种癌症中起到抗肿瘤的效果，但是miR-145同样可以刺激腹膜组织纤维化[13]。circRNA是一类含有多个外显子的环状RNA，广泛分布于多种生物细胞。其含有丰富的miRNAs结合位点，可通过竞争性内源RNA发挥作用，充当miRNAs的“海绵”，使其解除对靶基因的抑制，通过调节其它RNA的表达影响疾病的发生发展。加上circRNAs作为高度稳定且具有组织特异性的非编码RNA，因此，circRNAs是一种极具潜力的生物标志物，也是一种极具应用前景的目标靶点。既往Wu Y等[14]认为circ_0005105不影响miR-26a的表达，但抑制其转录活性，从而上调其靶标NAMPT的表达，circ_0005105抑制Ⅱ型胶原蛋白和聚集胶的表达，促进MMP-13和ADAMTS-4的表达，促进PGE2、IL-6和IL-8的生成；Ai Y等[15]研究显示，circ_0001461通过海绵miR-145调节口腔鳞状细胞增殖，迁移和侵袭。此外，circ_0001461通过调节miR-145/TLR4/NF-κB途径促进TNF-α诱导的口腔细胞凋亡。本次研究结果显示，circ-0030042在HS组织和细胞高水平表达；细胞功能试验显示，circ-0030042对HS细胞增殖、迁移及侵袭有一定的抑制作用，提示circ-0030042参与HS的发生发展，与上述实验结果相符合。

细胞的功能试验显示VEGF的过度表达可抑制miR-145细胞增殖、迁移和侵袭的活性。结果表明，circ-0030042为miR-145的主要载体，其作用机制是调节其目标基因VEGF的表达，进而对细胞的增殖、迁移和侵袭起到一定的作用；而miR-145可以与VEGF的3'UTR靶点相结合，证明circ-0030042或miR-145可以抑制VEGF mRNA及蛋白质的表达，对miR-145的抑制可以逆转circ-0030042对VEGF mRNA及蛋白质的表达。分析原因可知，VEGF是一种有丝分化的因子，它可以刺激血管内皮细胞的生长，VEGF与细胞膜上VEGF在低氧环境下与VEGF的受体发生相互作用，从而使VEGF增殖加快；VEGF能提高PA和PAI-1 mRNA的含量，从而提高PA的活性，进而加速细胞外蛋白水解，加速新的毛细血管生成[16-17]。而miRNA能够调控靶蛋白3'UTR区域基因并与之结合，从而实现靶基因的转录后调控，进而调节相关疾病的发病和发展[18]。此次利用联机生物资料库，本研究发现circ-0030042与miR-145之间存在着一个结合位点，并利用此结合位点进行了基因工程分析，证明circ-0030042能够与miR-145进行靶基因的融合，从而使细胞的增殖、迁移和侵袭受到了抑制，其效应与敲除circ-0030042的活性相吻合，而miR-145的抑制作用可以使circ-0030042活性发生逆转，说明circ-0030042可以通过与miR-145的竞争性结合来改变HSFBs的恶性生物学特性。

综上所述，circ-0030042可以与miR-145进行竞争性的相互作用，间接地调节其靶向因子VEGF的表達，从而调节HSFBs的增殖、迁移和侵袭。因此，circ-0030042/miR-145/PTEN轴位可以作为HS的发病机理和可能的治疗靶点。

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[收稿日期]2023-02-28

本文引用格式：张毓姣，郭智辉，孟艳斌，等.circ-0030042通过miR-145/PTEN轴调控对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及迁移的影响[J].中国美容医学，2024，33（1）：49-53.