小麦酰脲通透酶基因TaUPS2.1-D的克隆及等位变异分析

孟晓丹,苏秀荣,程琳,郝世军,张俊辉,李荣荣,任江萍,李磊,王小纯

(1.河南农业大学国家小麦工程技术研究中心,河南省小麦技术创新中心,河南 郑州 450046; 2.河南农业大学农学院,河南 郑州 450046; 3.河南农业大学生命科学学院,河南 郑州 450046)

氮作为蛋白质、核酸和磷脂的主要组成成分,在原生质、细胞核和生物膜中担任着重要角色,是制约小麦产量和品质的大量元素之一[1]。小麦是中国重要的粮食作物,然而小麦生产中,氮素利用效率往往较低,不仅影响小麦生产的经济效益,还导致氮素资源的损失和浪费,造成面源污染[1-2]。氮在植物体内的利用包括吸收、转运、再利用等过程,细胞内的所有蛋白是氮再利用的潜在来源,核酸(DNA和RNA)也是氮再利用的重要来源[3]。核酸中N含量约为15%～16%。嘌呤是核酸中重要的含氮碱基,来自于从头合成或游离碱基或核苷的重新利用[4]。

转运蛋白在细胞物质运输过程中起着重要作用,使各种分子能够在生物膜上移动,在养分吸收、运输和分配中起着至关重要的作用[3,14]。酰脲通透酶(ureide permease, UPS)是植物中参与酰脲和其他嘌呤、嘧啶派生物如尿嘧啶、尿酸等运输的一类转运蛋白[15-19]。酰脲一般在根(和根瘤)中合成[20],UPS参与酰脲从根经木质部向地上部、源叶片经韧皮部向籽粒等库器官运输的过程[14,21-22],从而影响酰脲在各个器官的积累和分配,参与植物体内的氮代谢[19,21-23]。前期利用酵母突变体和原位杂交的研究表明,小麦酰脲转运蛋白TaUPS2.1-D介导尿囊素的转运,参与多个组织器官及从源到库的长距离酰脲运输[6],但其亚细胞定位还不明确。等位变异有助于了解基因序列的多样性及其功能的保守性[24-27]。因此,本研究对TaUPS2.1-D基因进行克隆的基础上,对TaUPS2.1-D的亚细胞定位及等位变异进行分析。为利用TaUPS2.1-D基因提高小麦的酰脲利用效率、减少氮肥损失,从而增强农业可持续发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用本氏烟草(Nicotianabenthamiana)作为亚细胞定位的植物材料,主要试剂包括:TaKaRa LA Taq; DNA纯化回收试剂盒;TaKaRa pMD19-T载体;TaKaRa限制性内切酶KpnI和XbaI、T4DNA连接酶;卡那霉素、氨苄霉素和利福平3种抗生素;大肠杆菌DH5α感受态细胞;农杆菌EHA105感受态细胞。pCAMBIA-GFP空载质粒由河南农业大学国家小麦技术创新中心(筹)李永春老师馈赠。

1.2 试验方法

1.2.1TaUPS2.1-D基因编码区克隆 利用Primer Premier 5.0软件设计上游引物F1(5′-ataGGTACC ATGGCCATGGACCATGCTCTGG-3′)和下游引物R1(5′-ataTCTAGA TTTTGTGCTCCTGTGACCTGCTG-3′),以植物代谢与信号转导实验室保存的周麦27的cDNA为模板,对TaUPS2.1-D基因进行克隆。PCR反应体系为TaKaRa LA Taq(5 U·μL-1) 0.2 μL;10×LA Taq Buffer II(Mg2+Plus) 2 μL;dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1each) 3.2 μL;模板约0.5 μg;引物F1和R1各1.0 μmol·L-1(终浓度);加灭菌水补至20 μL。PCR反应条件为94 ℃ 1 min;98 ℃ 10 s、68 ℃,2 min(30～40个循环);72 ℃,10 min。PCR扩增产物进行质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测,对目的条带进行纯化。纯化产物与克隆载体pMD19-T连接后,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞[28]。利用上游引物F1和pMD19-T载体上的下游引物R2(5′-GAGTTGGATGCTGGATGGGATTACGCCAAGTTTGCACG-3′)进行菌液PCR鉴定,并测序。引物合成和测序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。测序正确的菌液进行质粒提取。

1.2.2 TaUPS2.1-D亚细胞定位载体的构建及烟草瞬时转化 为了构建TaUPS2.1-D-GFP融合表达载体,用KpnI和XbaI对pCAMBIA-GFP空载质粒和含有TaUPS2.1-D的克隆载体pMD19-T质粒分别进行双酶切,酶切反应体系如下:KpnI,1 μL;XbaI,1 μL; 1×mol·L-1Buffer 2 μL;质粒DNA 1 μg;加双蒸水至20 μL。37 ℃反应5 h后,对酶切产物中的目的片段进行纯化,纯化后将目的片段进行连接。连接体系:载体DNA 20～100 ng;插入DNA片段:载体为1∶1～5∶1;10×Ligation Buffer 2 μL;T4 DNA连接酶 0.5 μL;双蒸水补充至10 μL。与载体连接后,转化,挑取单克隆,使用引物F3(5′-ACTGACGTAAGGGATGACGCAC-3′)和R3(5′-CGTGCTGCTTCATGTGGTCG-3′)进行菌液PCR鉴定并测序。测序正确的菌液进行质粒提取。用冻融法将质粒导入农杆菌EHA105感受态细胞中,将目的基因菌液和marker菌液培养至合适浓度,按一定体积比混匀注射烟草[29],利用激光共聚焦显微镜(德国蔡司公司,LSM710 全电动倒置荧光显微镜)观察荧光信号。内质网marker由河南农业大学植保学院施艳老师馈赠,细胞质膜marker由河南农业大学国家小麦技术创新中心(筹)王鹏飞老师馈赠。

1.2.3TaUPS2.1-D序列等位变异位点及频率分析 借助SnpHub网站(http://wheat.cau.edu.cn/Wheat_SnpHub_Portal/)[30],利用公开发表的重测序和外显子捕获等数据[31-38],对TaUPS2.1-D序列在不同小麦品种中的等位变异位点及变异频率等进行分析。

2 结果与分析

2.1 小麦TaUPS2.1-D基因的克隆及融合表达载体构建

以周麦27的总RNA反转录所得的cDNA为模板,以引物F1和R1扩增TaUPS2.1-D编码区,电泳检测PCR扩增产物,结果如图1-A所示。3、4泳道1 000～2 000 bp之间的条带大小与预期TaUPS2.1-D基因编码区长度相符,对此片段进行切胶回收。将回收的目的基因片段与pMD19-T载体连接,菌液PCR鉴定结果如图1-B所示,其中泳道2、4、5、6、8、9号条带均含有目的条带,选择4泳道对应的菌落进行测序,测序正确,提取质粒用于下一步试验。

M:DL2 000 DNA分子量标准;1～9代表泳道。A.PCR扩增TaUPS2.1-D目的基因产物的电泳检测;B.大肠杆菌的菌液PCR鉴定结果;C.TaUPS2.1-D-GFP融合表达载体双酶切后电泳检测;D.农杆菌菌液PCR鉴定。M:DL2 000 DNA marker;1-9 represents the lane. A.Electrophoretic detection of TaUPS2.1-D target gene products amplified by PCR; B.PCR results of Escherichia coil liquid; C.Electrophoretic detection of TaUPS2.1-D GFP fusion expression vector after double enzyme digestion; D.PCR identification of Agrobacterium solution.

用KpnI和XbaI对pCAMBIA-GFP空载和含有TaUPS2.1-D的克隆载体pMD19-T质粒分别进行双酶切,目的条带切胶纯化后,进行连接,转化,提取质粒,KpnI和XbaI双酶切结果如图1-C所示,表明目的片段成功连接到载体质粒中。选择阳性质粒去测序,测序结果与中国春TaUPS2.1-D编码区序列完全吻合,且TaUPS2.1-D与GFP接口处没有出现碱基突变或移码突变,说明TaUPS2.1-D-GFP融合表达载体构建完成。将测序正确的质粒转化到农杆菌EHA105感受态细胞中。利用引物F3和R3进行菌液PCR鉴定。结果如图1-D所示,除了3号泳道对应的菌液之外,其他泳道对应的菌液的PCR条带大小与预期基本相符。选取鉴定为阳性的菌液进行测序。测序正确的对应农杆菌菌液扩繁后,用于注射烟草。

2.2 TaUPS2.1-D亚细胞定位分析

为了明确TaUPS2.1-D蛋白在亚细胞水平的具体定位,本研究将携带TaUPS2.1-D-GFP融合表达载体的农杆菌EHA105和含有红色荧光marker载体的农杆菌扩大培养后,按3∶1的比例混合,注射到烟草叶片的下表皮中进行瞬时表达。通过激光共聚焦显微镜观察荧光信号,结果显示,细胞质膜(图2-A)、内质网(图2-B)均能观察到明显的绿色荧光信号,且都能与对应marker的红色荧光信号重合,表明TaUPS2.1-D在细胞质膜、内质网上均有表达,由此可知TaUPS2.1-D转运蛋白是一种跨膜转运蛋白。

A和B,从左到右分别表示TaUPS2.1-D-绿色荧光蛋白,红色荧光标记,明场,绿色荧光、红色荧光和明场叠合。A中marker为质膜marker AtRCI2B,B中marker为内质网marker HDEL-mcherry。比例尺为20 μm。A and B,from left to right,represent TaUPS2.1-D-green fluorescence,red fluorescence marker.bright field,green fluorescence superimposed red fluorescence and bright field, respectively.Marker in A is plasma membrane marker AtRCI2B,and marker in B is endoplasmic reticulum marker HDEL-mcherry.Scale bar is 20 μm.

2.3 TaUPS2.1-D基因的等位变异分析

为了明确TaUPS2.1-D基因在不同小麦品种中是否存在等位变异,利用公开发表的小麦基因组测序数据集(详见SnpHub网站)对TaUPS2.1-D基因的序列多样性进行分析[30-38]。结果表明,其中有4个数据集中TaUPS2.1-D基因不存在等位变异(表1)。另外5个数据集中,TaUPS2.1-D基因均存在变异,变异位点数目在0～17之间,变异类型主要包括3种:同义突变、错义突变和其他(表1)。所有变异位点的变异频率均较低,接近0%(图3),表明此基因仅在个别品种中存在等位变异,在大多数小麦品种中序列较为保守。

表1 TaUPS2.1-D基因的变异位点数目及类型Table 1 Variation locis and types of TaUPS2.1-D gene

图3 TaUPS2.1-D基因的变异位点分布Fig.3 Distribution of variation locis of TaUPS2.1-D in tobacco leaf

3 结论与讨论

由于较高的氮碳比,酰脲是一种有效的氮储存和转运形式[8]。UPS在豆科植物和拟南芥中已被广泛研究[15-16,18-19,39]。在固氮和非固氮豆科植物中,操纵UPS的表达,导致尿囊素和尿囊酸从根转运到源叶片的过程受到影响,而且影响种子产量和蛋白质含量[19,40]。近年来禾本科植物相关研究表明,过表达水稻OsUPS1,导致尿囊素和总游离氨基酸的积累增强。在适氮条件下,过表达水稻OsUPS1的植株没有明显表型;减氮条件下,过表达OsUPS1的植株分蘖数增加[41]。

蛋白质不仅是生物功能的直接体现者,还可以通过其有序的分布和动态调控,促进生命个体的正常生长和发育,因此对蛋白质进行亚细胞定位是研究其功能的重要步骤之一[42]。前人研究表明,UPS大多定位在细胞质膜[19,40-41],也有研究表明,UPS定位较为复杂,还定位在内质网、高尔基体等部位[39]。本研究亚细胞定位结果显示,TaUPS2.1-D定位在细胞质膜和内质网,表明TaUPS2.1-D是一种跨膜转运蛋白,还可能参与内质网中尿囊素降解的过程[39]。TaUPS2.1-D基因的等位变异分析表明,TaUPS2.1-D基因仅在个别小麦品种中存在等位变异,在大多数小麦品种中序列较为保守。以上关于小麦酰脲转运蛋白TaUPS2.1-D的研究,对于利用酰脲转运蛋白来提高小麦酰脲利用效率,从而提高小麦的产量和氮素利用效率具有重要意义。