桑寄生配方颗粒中槲皮苷近红外定量分析模型的建立

籍瑞芳，刘会，史敏，林超

（济南市食品药品检验检测中心，济南 250102）

桑寄生配方颗粒是以中药饮片桑寄生为原料，经水提、浓缩、干燥、制粒等现代生产工艺制成的新型中药颗粒剂，经中医临床配方后，与其它配方颗粒一起冲服使用[1]。由于配方颗粒具有方便冲服、易于携带、安全卫生等特点，现已成为中药饮片的重要替代品。特别是在2021年11月1日《关于结束中药配方颗粒试点工作的公告》正式实施之后，中药配方颗粒迎来了更加广阔的发展空间[2]。目前临床常用的饮片品种约为400 个，已颁布国家药品标准的配方颗粒品种有248 个，已颁布山东省药品标准的配方颗粒品种有366 个，可见60%以上的临床常用饮片可以用配方颗粒代替。常规检验方法对配方颗粒市场可以起到监督和评价作用，但面对日益扩大的市场，这些方法往往耗时较长、操作复杂、对实验环境要求较严格，难以应对快速增长的市场需求，因此需要建立一种能够满足大批量快速检验要求的方法。

近红外光谱(NIRS)法是通过测定物质在近红外光谱区的特征光谱，利用化学计量学方法提取相关信息，对物质进行定性和定量分析的光谱分析技术[3]。由于该方法具有对样品无破坏、操作简单、不产生毒害物质、高效便捷等优点，现已广泛应用于农产品、中药材、生物制品、化工产品等领域，而用于配方颗粒质量研究文献报道较少。孙夏荣等[4]利用近红外光谱对当归配方颗粒进行了一致性检验；李军山等[5]通过近红外光谱建立了赤芍配方颗粒中芍药苷和浸出物的含量测定模型，为配方颗粒的定性、定量分析开辟了新方法。由于近红外光谱基频振动弱，吸收峰重叠，需要利用化学计量学方法提取相关信息，目前研究的重点集中在探索更加准确的分析方法，建立稳定的分析模型。

桑寄生中的主要药物活性成分为黄酮类化合物[6]，桑寄生配方颗粒的国家药品标准的含量测定项下是以槲皮苷为指标物质。笔者将桑寄生配方颗粒通过高效液相色谱(HPLC)法测定的槲皮苷含量值与其近红外光谱相关联，利用偏最小二乘(PLS)法，建立桑寄生配方颗粒中槲皮苷的定量分析模型，并对模型进行了验证，为快速测定桑寄生配方颗粒中槲皮苷的含量提供了参考方法，为实现对中药配方颗粒的现场鉴定及提高药品质量监管水平提供有力的技术支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1200 型，附有ChemStation工作站，美国安捷伦科技有限公司。

电子天平：(1) MS205DU 型，感量为0.01 mg；(2) MS204TS/02 型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器公司。

数控超声波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司。

傅里叶变换近红外光谱仪：MATRIX-F 型，配漫反射光纤探头和OPUS 5.0分析软件，德国布鲁克光谱仪器公司。

槲皮苷对照品：纯度(质量分数)为93.5%，批号为111538-202007，中国食品药品检定研究院。

桑寄生配方颗粒样品：共90批，市售。

乙腈：色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司。

乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 高效液相色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(50 mm×4.6 mm，1.8 μm，美国安捷伦科技有限公司)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液，体积比为20∶80，流量为1.0 mL/min；检测波长：350 nm；柱温：30 ℃；进样体积：2 μL。

1.2.2 槲皮苷对照品溶液制备

取槲皮苷对照品9.51 mg，置于100 mL 容量瓶中，加入稀乙醇溶解并稀释至标线，摇匀，配制成槲皮苷质量浓度为88.92 μg/mL的槲皮苷对照品溶液。

1.2.3 桑寄生配方颗粒样品溶液制备

取桑寄生配方颗粒，研细，精密称取约0.2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，作为桑寄生配方颗粒样品溶液。

1.2.4 槲皮苷含量测定

分别精密吸取槲皮苷对照品溶液和桑寄生配方颗粒样品溶液，按1.2.1 色谱条件进样测定，采用色谱峰面积外标法计算90 批桑寄生配方颗粒样品中槲皮苷的含量。

1.2.5 近红外光谱的采集

取桑寄生配方颗粒样品，研细，装入塑料袋中，将光纤探头在塑料袋外，对准颗粒直接进行光谱测定，采集近红外光谱。采集光谱范围为4 000～12 000 cm-1，分辨率为8 cm-1，扫描次数为32次。每份样品测定3 次，取其平均光谱数据用于建立定量分析模型。

1.2.6 定量分析模型建立

通过主成分分析(PCA)法结合HotellingT2方法[7]剔除异常红外光谱样本，优选出最佳的样本划分方法，将HPLC 法测得的桑寄生配方颗粒样品中的槲皮苷含量与其近红外光谱相结合，采用PLS法，用校正集样本建立桑寄生配方颗粒中槲皮苷的定量分析模型，并用验证集样本对该模型进行验证。在近红外定量分析模型中，交叉检验均方根误差(RMSECV)、预测均方根误差(RMSEP)和决定系数(R2)是衡量模型的重要依据。其中RMSECV 和RMSEP 值越小，表明模型结构越合理，预测值与参考值的差异越小；R2越接近100%，证明模型的预测值与样品参考值的相关性越好，模型的准确性越高[8]。

2 结果与讨论

2.1 样品中槲皮苷含量HPLC法测定值

槲皮苷的含量测定方法采用国家药品标准YBZ-PFKL-2021107 中桑寄生配方颗粒含量测定方法。槲皮苷的质量分数为3.768 2～7.199 7 mg/g。槲皮苷对照品溶液和样品溶液的色谱图如图1 所示。HPLC法测定的含量值是建立定量分析模型的一级数据，也是判断预测值是否准确的重要参考。

图1 槲皮苷对照品溶液和桑寄生配方颗粒样品溶液色谱图Fig.1 Chromatograms of quercitrin reference solution（a） and Taxilli herba formula granule sample solution（b）

2.2 近红外光谱图

桑寄生配方颗粒样品的近红外光谱图如图2所示。90 批桑寄生配方颗粒样品的近红外光谱除吸收强度不同之外，峰形基本一致。

图2 桑寄生配方颗粒的近红外光谱图Fig.2 Near-infrared spectrum of Taxilli herba formula granule

2.3 异常光谱剔除

在近红外光谱采集过程中，由于环境温度和湿度的变化、检验人员的操作失误，以及样品的厚度不均匀等因素，会导致异常光谱的出现，对模型精确度产生影响[9]，因此在建立模型之前，应当对异常光谱进行识别和剔除。

利用PCA法结合HotellingT2方法对90批桑寄生配方颗粒样品的近红外光谱进行异常样本检测，结果如图3 所示。图中18#样本位于99%置信期间之外，为异常样本，剔除18#样本后得到89 份样本，将其数据用于定量分析模型的建立。

图3 桑寄生配方颗粒样品近红外光谱Hotelling T 2检验结果Fig.3 Hotelling T 2 test result of near-infrared spectrum of Taxilli herba formula granule

2.4 校正集与验证集划分

划分校正集和验证集的常用方法有随机(RS)法、Kennard-Stone (KS)法和X-Y 联合距离的样本集划分(SPXY)法。RS法即随机选取一定量的样本组成校正集和验证集；KS法是通过计算光谱样本间的欧氏距离，使在规定的样本集内，样本按照空间距离分布均匀，尽可能包含多样的样本信息；SPXY法以KS法为基础，综合考虑参考值变量，使样本在光谱空间和参考值空间权重相同，从而使样本集的分布更加均匀，改善模型的预测能力[10]。

将89 个样本中的3/4 (67 个)作为校正集，1/4(22 个)作为验证集，分别采用RS 法、KS 法和SPXY法进行划分，在对光谱无预处理和全光谱条件下，对三种划分方法进行评价，结果见表1。由表1数据可知，三种方法中，SPXY 法的RMSECV 值最小，R2值更接近100%，说明该方法划分出的校正集和验证集更加合理。67 个校正集样本中槲皮苷的质量分数范围为3.768 2～7.199 7 mg/g，包含了槲皮苷的最大值、最小值，其余22个样本为验证集，其槲皮苷的含量范围均被校正集范围包含，可用于判断模型的预测能力。

表1 三种样本划分方法的结果Tab.1 Three sample partitioning methods results

2.5 光谱预处理方法选择

光谱预处理能有效提取光谱中的有效信息，消除在采集过程中由于噪声、背景、杂散光等因素产生的干扰信息，提高光谱模型的预测效果[11]。常用的光谱处理方法有原始光谱(NONE)法、线性补偿差减(COE)法、直线差减(SLS)法、矢量归一化(VN)法、最小-最大归一(M-MN)法、多元散射校正(MSC)法、一阶导数(FD)法、二阶导数(SD)法等。在全光谱条件下，对上述几种方法进行试验，结果列于表2。由表2可知，VN法的RMSECV值最小，R2值最大，VN法可以消除光程变化导致的基线平移[12]。

表2 十二种光谱预处理方法的结果Tab.2 Results of twelve spectral pretreatment methods

2.6 光谱区间选择

采用VN 法预处理光谱，选择12 000～4 000 cm-1(全光谱)，7 502～4 597.6 cm-1(软件自动优化功能选出的光谱区)以及7 256～6 817 cm-1、5 736～5 052 cm-1(槲皮苷的光谱叠加敏感区[13])分别进行试验，结果列于表3。由表3 数据可知，最佳光谱区为7 502～4 597.6 cm-1。

表3 三种光谱区间的结果Tab.3 Results of three spectral intervals

2.7 主因子数选择

定量分析模型的质量取决于所需因子的数量，主因子数太少会因拟合不足导致模型不能解释全部特性，但主因子数太多会导致过度拟合而增加噪声，降低模型的质量即预测能力[14]。

图4 是在经VN 法预处理光谱，选用7 502～4 597.6 cm-1光谱区间条件下RMSECV 与主因子数的关系图，当主因子数大于11 之后，RMSECV 值变化幅度变缓，所以最佳主因子数为11。

图4 交叉检验均方根误差与主因子数的相关图Fig.4 Correlation graph of the root mean square error of cross validation with the number of principal components

2.8 定量分析模型建立

测定桑寄生配方颗粒样品中槲皮苷含量的定量分析模型参数总结于表4。

表4 定量分析模型的参数Tab.4 Parameters of the quantitative analysis model

2.9 定量分析模型验证

按照上述定量分析模型，对验证集样本中的槲皮苷含量进行预测，图5 为HPLC 法测得桑寄生配方颗粒样品中槲皮苷含量值与预测值的相关图，模型的RMSEP 为0.132，R2为98.68%，剩余预测偏差(RPD)为8.98。如果RPD 大于10，说明所建模型可以准确预测所测成分的含量值；RPD在5～10之间，说明模型可以用于质量控制；RPD 在2.5～5 之间，说明模型只能对所测成分的含量值进行高低判断[15]。

图5 验证集样品预测值与高效液相色谱法测定值相关图Fig.5 Correlation graph of the predicted value of the validation set sample and the determined value by HPLC

将预测值与HPLC测定值进行样品配对t检验，设置信水平为95%，双尾P值为0.191，大于0.05，表明使用HPLC法测得的槲皮苷含量值与用近红外光谱法预测的含量值差异不明显，所建立的近红外定量分析模型可以准确预测桑寄生配方颗粒中的槲皮苷的含量。

3 结语

采用HPLC法测定桑寄生配方颗粒中槲皮苷的含量，使用近红外光谱仪采集桑寄生配方颗粒的近红外光谱，利用PCA法结合Hotelling T2方法剔除异常光谱，采用SPXY法划分出校正集和验证集，利用PLS法确立了桑寄生配方颗粒中槲皮苷含量测定的定量分析模型。该定量分析模型可快速完成大批量样本的检验，有良好的预测能力，能够满足药物的快速筛查。有利于各级药监机构监督评价各个厂家生产的桑寄生配方颗粒的质量，有助于促进厂家生产工艺的规范化，提高产品质量。