甲状腺乳头状癌及其临床病理特征与Braf蛋白表达、BRAF V600E基因突变之间的关系

林文松,黄 冠,林宝行

(深圳市龙岗中心医院,广东 深圳 518000)

约有50%的甲状腺癌为甲状腺乳头状癌,可局限于甲状腺病灶内数年,临床高发群体为儿童或女性[1]。甲状腺乳头状癌生长较缓慢,可由原发部位经腺内淋巴管向其他腺体部位扩散[2]。BRAF V600E基因突变发生于29%～83%的甲状腺癌,激活RAS/RAF/促分裂原活化蛋白激酶途径congress导致细胞的恶性增殖。本研究分析甲状腺乳头状癌的临床病理特征与BRAF V600E基因之间的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2019年7月～2020年2月在深圳市龙岗中心医院就诊的甲状腺乳头状癌患者100例,年龄26～67岁,平均(52.4±3.2)岁;男34例,女66例。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。纳入标准:符合WHO制定的甲状腺乳头状癌的诊断标准[3];经临床病理检查、超声等检查确诊。组织学分型:混合型21例,囊内型12例,嗜酸细胞型10例,高细胞型16例,滤泡型10例,经典型31例。病变部位:其中46例局限于甲状腺内;肿瘤直径1～4 cm,平均(2.1±0.3)cm;肿瘤单发62例,多发38例。疾病分期:Ⅰ期～Ⅱ期58例,Ⅲ期～Ⅳ期42例。颈部淋巴结转移46例。

1.2方法:白片切取肿瘤组织蜡块,提取DNA,厚度为8 μm,白片内刮取肿瘤组织。根据DNA试剂说明书严格执行,提取基因组DNA。PCR扩增,引物合成,PAGE纯化。PCR反应体系:10 μl去离子水,1 μl引物(3.2 μmol/L),8 μl BigDye(2.5X),1 μg/L PCR纯化产物(10 μg/L);PCR反应产物:95℃预变性7 min,95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 45 s,共循环40次,72℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后纯化,PCR产物纯化后测序。BRAF扩增测序:50 μl反应体积,含DNA模板50 ng,10 pmol上、下游引物,1.5U Taq酶,0.2 mmol/L dNTPs终浓度。乙醇、醋酸钠纯化测序产物后,基因分析仪测序基因,应用Sequencing软件读取序列。RO82-W-1、K1提取浓度为30 ng/μl DNA,将BRAF基因V600E突变(K1)、RO82-W-1野生型BRAF基因的DNA相混合,获得DNA混合模板(1%、3%、10%、25%、50%突变),30 ng等位基因PCR特异性扩增,DHPLC分析扩增产物。分析甲状腺乳头状癌临床病理特征和BRAF V600E基因、BRAF之间的关系。

1.3统计学分析:采用SPSS21.0软件系统处理分析,计数资料以[n(%)]表示,行χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。对BRAF V600E基因突变、甲状腺乳头状癌病理因素Logistic回归分析,亚变量为多分类变量,自变量为患者的资料,因变量为BRAF V600E基因突变,逐步回归变量筛选标准为P<0.05。

2 结果

2.1甲状腺乳头状癌临床病理特征和BRAF V600E基因突变:BRAF V600E基因突变、BRAF蛋白表达与肿瘤随诊6个月～2年复发/远处转移、肿瘤分期、肿瘤大小、年龄等因素密切相关,差异有统计学意义(P<0.05),100例甲状腺乳头状癌出现钙化者为47例(47.0%),通常具有粗大片状钙化、砂砾样钙化,研究发现BRAF基因突变状态与钙化类型、是否出现钙化无明显相关性。见表1～3,图1～4。

图1 肿瘤组织侵袭甲状腺被膜外横纹肌组织(HE,×20)

图2 甲状腺乳头状癌高细胞亚型,癌细胞宽度为高度的1/3 (HE,×40)

图3 BRAF V600E未发生突变,为野生型

图4 BRAF V600E 基因突变型

表1 甲状腺乳头状癌临床病理特征和BRAF V600E基因突变及BRAF蛋白表达分析[n(%)]

表2 甲状腺乳头状癌BRAF V600E基因突变影响因素的Logistic回归分析

表3 甲状腺乳头状癌B-raf蛋白表达影响因素的Logistic回归分析

3 讨论

甲状腺乳头状癌超声声像图显示边界明确、呈不规则状,为玻璃样变性,内部回声欠均匀,实质性,内部出现乳头状凸起,囊肿大小不一,部分实质出现纤维化,随着病情的进展出现钙化、甚至骨化[4-5]。桥本甲状腺炎、碘缺乏、甲状腺肿物质、放射性物质、环境、遗传、激素等因素均为甲状腺乳头状癌的诱发因素[6-7]。甲状腺乳头状癌首发临床特征为无痛性颈部肿物,随着吞咽可上下移动,少数出现压迫感、吞咽困难、声音嘶哑等症状[8-9]。近年随着基因测序的不断发展,发现甲状腺乳头状癌与某些基因突变密切相关,同时可用于评估临床预后[10-11]。目前,甲状腺乳头状癌的临床病理特征与BRAF 600E基因之间的关系已成为医学热点研究课题[12]。

本研究观察甲状腺乳头状癌临床病理特征和BRAF V600E基因之间的关系,结果与Elliott Range D等[13]的研究结果大体一致,ERK/MAP激酶信号通路和下游产物对细胞的增殖及分裂起到重要作用[14]。BRAF基因编码为丝氨酸-苏氨酸激酶,基因位于7q34,是KRAS的下游反应分子,是最强的MAPK信号传导通路激活剂,密码子600突变是其主要的突变位点,激活磷酸化后在传导RAS-RAF-NEK-ERK信号通路中发挥重要作用[15-16];BRAF常在第15号外显子密码子600位点出现突变,胸腺嘧啶向腺苷酸转化后,颉氨酸在氨基酸水平代替谷氨酸,突变位点又称为BRAF V600E[17-18]。约有30个BRAF基因位点突变,其中90%为V600E。临床发现甲状腺乳头状癌与肿瘤复发/远处转移、肿瘤分期Ⅲ期～Ⅳ期、肿瘤直径3～4 cm、年龄超过45岁者的BRAF V600E基因突变率更高,说明甲状腺乳头状癌的BRAF V600E基因突变可用于评估甲状腺乳头状癌的预后状态。甲状腺乳头状癌的预后与甲状腺被膜外侵犯密切相关,病灶组织侵袭被膜及邻近被膜时的复发转移概率显著增高,说明病灶组织侵袭甲状腺外后极易出现区域淋巴结转移、淋巴管道播散。同时研究发现,甲状腺乳头状癌经典亚型的BRAF突变比率显著升高,显著高于嗜酸细胞型及滤泡型。100例甲状腺乳头状癌出现钙化者为47例(47.0%),通常具有粗大片状钙化、砂砾样钙化,研究发现BRAF基因突变状态与钙化类型、是否出现钙化无明显相关性。BRAF基因主要职责在于RAF激酶蛋白的细胞信号传递编码,致癌基因为VRAF基因,该蛋白属于RAS-RAF-MEK-ERK信号通路的组成部分,可导致正常细胞转变为肿瘤细胞。BRAF突变是甲状腺乳头状癌的常见发病原理。在正常情况下,RAF蛋白会按照信号接收状态对下游信号通路的细胞及活动进行控制,但BRFA基因产生于致病性突变时,可持续激活RAF蛋白,在未接收到化学信号时也持续对其下游通路传导信号,导致细胞不受控制的增殖与生长。V600E为常见的致癌性BRAF基因突变位点。

综上所述,甲状腺乳头状癌的临床病理指标与BRAF V600E基因突变、B-raf蛋白表达密切相关,是评估甲状腺乳头状癌的相关预后因子之一。