高效液相色谱法（HPLC）测定乐脉丸中丹参素钠含量

＊宋易 易琦铭

（贵州轻工职业技术学院 贵州 550025）

中药制剂在世界各地尤其是亚洲地区具有悠久的历史和广泛的应用。乐脉丸是一种传统的中药制剂，主要用于治疗心血管疾病，如心绞痛、心肌缺血、冠心病等[1]。

乐脉丸主要由丹参、川芎、赤芍等中药材组成[6]，其中丹参素钠是丹参的主要活性成分之一。近年来，许多研究已经采用HPLC对中药制剂中的活性成分进行测定。然而，关于乐脉丸中丹参素钠含量的HPLC测定研究相对较少。本研究通过建立一种可靠、准确的HPLC方法，用于测定乐脉丸中丹参素钠的含量。通过对不同品牌、不同批次乐脉丸样品的测定，评估其质量差异，为乐脉丸的质量控制和产品研发提供有力支持。

1.实验部分

（1）仪器与试剂。高效液相色谱仪岛津LC-20AT；色谱柱Waters XBridge C18（4.6mm×250mm，5μm）；电子天平奥豪斯EX125DZH；超声清洗仪KQ-500DA（昆山市超声仪有限公司）；移液枪L-1000大龙；丹参素钠对照品中国食品药品检定研究院；冰醋酸科密欧；色谱甲醇TEDIA；乐脉丸贵州景峰制药有限公司；乐脉丸康美保宁（四川）制药有限公司。

（2）溶液配制。①对照品溶液的制备。称取丹参素钠对照品适量，精密称定，加70%甲醇溶液制成每1mL含22.75μg的溶液，即得。②供试品溶液的制备。取乐脉丸粉末0.4g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密量取25mL 70%甲醇，称定重量，超声60min（功率100W，频率40kHz，温度4～10℃），用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液经0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

（3）色谱条件。色谱柱：Waters C18柱（4.6mm×250mm，Column），流动相以甲醇-0.2%冰醋酸（10:90），柱温30℃，检测波长280nm，流速1mL/min，进样量10μL。理论塔板数按丹参素钠峰计算应不低于6000。

2.结果与讨论

(1)提取时间的考察

①提取溶剂体积分数筛选。分别用甲醇体积分数为：50%、70%、75%、80%、90%提取乐脉丸，按上述方法制备该供试品溶液，以上述色谱条件，采用HPLC法进行提取溶剂浓度筛选。

通过用不同体积分数的甲醇对乐脉丸进行提取并测定，实验结果显示，乐脉丸中70%甲醇提取时丹参素钠的含量最高，其含量值为2.219mg/g，则最终本实验中最佳提取甲醇体积分数为70%。

②提取时间的考察。按上述提取操作，70%甲醇为提取溶剂，将乐脉丸样品分别超声10min、20min、30min、45min、60min、70min，以上述的色谱条件，采用HPLC法进行超声提取时间的筛选。

通过对不同超声时间的考察，数据显示，超声随着超声（功率100W，频率40kHz）时间的延长，乐脉丸中丹参素钠的含量随之增加，超声60min与70min时含量值趋于平稳，考虑到节约时间时间最终本实验中提取乐脉丸中丹参素钠的超声时间为60min。

(2)精密度

取丹参素钠对照品溶液（22.75μg/mL），同一瓶对照品溶液，进样6次，上述色谱条件，以丹参素钠的峰面积计算，由结果计算其RSD值为0.28%，精密度达到要求。

(3)线性关系考察

取5个不同浓度的丹参素钠对照品溶液，进样量10μL，采用HPLC法对丹参素钠进行测定，以丹参素钠峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，得线性回归方程：y=6368.9x-6156.5（r=0.9999），范围：0.1468～2.2945mg，结果见表1。

表1 线性关系考察

(4)重复性实验

取同一批号的乐脉丸样品，照上述方式制备该供试品溶液共6份，以丹参素钠的峰面积计算，得丹参素钠RSD=0.67%，重复性数据达到数据要求，供试品重现性良好。

(5)中间精密度实验

由不同的操作人员，取同一批号乐脉丸，照上述方式制备供试品溶液6份，上述色谱条件，进行丹参素钠含量测定，以丹参素钠的峰面积计算，RSD值：1.32%。

(6)稳定性实验

取前序制备的同一样品溶液，同一瓶供试品依次在0h、2h、4h、6h、8h、12h的间隔时间内进样，共测6次，以丹参素钠面积计算，结果表明是否供试品在12h内丹参素钠峰面积前后没有明显变化。

(7)加样回收率试验

取同一批号乐脉丸粉末0.2g，精密称定，共6份，分别于50mL锥形瓶内，加入70%甲醇配制丹参素钠对照品溶液0.505mg，按照“3.1.3”项下制备供试品溶液，按上述色谱条件，进行测定，计算丹参素钠的平均加样回收率为99.8%，RSD值为1.14%，达到准确度要求。

(8)耐用性变化实验

①流速微小变化。分别以0.98mL/min、1.00mL/min、1.02mL/min为流速，测定样品相关数据，考察其分离效果，结果见表2。

表2 流速的微小变化

由实验结果表明，当流速出现微小变化时，理论塔板数、拖尾因子及分离度不受影响。

②流动相比例的微小变化。分别以流动相比例为甲醇-0.2%冰醋酸（12:88）；甲醇-0.2%冰醋酸（10:90）；甲醇-0.2%冰醋酸（8:92）；测定样品相关数据，考察其分离效果，结果见表3。

表3 流动相比例的微小变化

实验结果显示，流动相的微小变化对样品的分离效果无影响。

③柱温的微小变化。分别以28℃、30℃、32℃为柱温，测定样品相关数据，考察其分离效果，结果见表4。

实验结果表明，当柱温出现微小变化时，实验测定方法不受其影响。

(9)专属性试验

分别取丹参素钠阴性样品溶液、丹参素钠对照品溶液、供试品溶液、溶剂（70%甲醇），进样体积10μL，上述方法进行数据采集，结果见图1、图2、图3、图4。

图1 溶剂

图2 乐脉丸样品

图3 丹参素钠对照品

图4 缺丹参素钠阴性样品

溶剂与阴性样品在丹参素钠峰位置均无阴性干扰。

(10)样品含量测定

按照上述方法制备供试品溶液，以上述色谱条件，测定6个批号的乐脉丸中丹参素钠的含量，1～3为景峰制药有限公司产品，4～6号为康美保宁（四川）制药有限公司产品。实验结果见表5。

表5 乐脉丸中丹参素钠含量测定统计表

由数据显示，两种不同品牌间3个批次的乐脉丸中丹参素钠的含量值相差无几。

3.讨论

通过文献[7-9]阅读，经过多次方法调整，对乐脉丸样品提取时甲醇溶剂体积分数、提取时间的考察，结果表明70%甲醇提取效果最好，超声60min时丹参素钠的含量最高。实验中通过对色谱条件中流速、流动相及柱温的微小变化进行实验，由实验结果表明，从样品中检测出的丹参素钠峰形、拖尾因子和对称性来看，当流速、流动相及柱温发生微小改变时，拖尾因子、分离效果与对称性不理想，比较下来，则选择流动相比例为甲醇-0.2%冰醋酸（10:90），流速为1mL/min，柱温为30℃。

为研究市面不同品牌乐脉丸质量差异，对两种不同品牌的乐脉丸中丹参素钠含量进行测定，发现其丹参素钠含量相当，质量几乎无差别。

未来，我们将继续优化实验方法，同时测定乐脉丸中不同成分的含量，以期更全面的对乐脉丸的质量进行评价，为中药质量控制和产品研发做出更多贡献。