HPLC法测定骨伤跌打康复凝胶贴膏剂中7种成分含量

吴谋，莫楚铭，蓬展鹏，刘淑芳，陈继英

（1.东莞市中医院，广东 东莞 523000；2.东莞市中药制剂重点实验室，广东 东莞 523000）

外用中药制剂在骨科诊疗过程中起着重要的作用，特别是治疗急性软组织损伤独具特色，临床疗效满意，常用的剂型有敷贴药、涂擦药、热熨药及熏洗湿敷药等[1]。近年来，凝胶贴膏剂因具有不容易过敏、容易贴敷、不污染衣服等独特优势，备受患者欢迎。

骨伤跌打康复凝胶贴膏剂是我院根据临床需求研发的新制剂，处方由牛膝、大黄、黄柏、骨碎补等27味中药组成，以逐瘀通经、补肝肾、强筋骨的牛膝和同样具有逐瘀通经并可以凉血解毒的大黄为君药；补血活血的当归尾，清热解毒疗疮的黄柏，破血行气的三棱莪术，活血散瘀、定痛的乳香，和消肿生肌的没药为臣药；行气利湿、舒筋活络的五指毛桃、络石藤、鸡骨香、骨碎补等为佐使药，增强君臣药的消肿止痛、通络之功。具有活血散瘀、消肿止痛功效，用于跌打扭伤、筋骨损伤、积瘀肿痛等软组织损伤症。由于处方药味比较复杂，对于制剂质量控制要求更高，本文建立了骨伤跌打康复凝胶贴膏剂中7种主要成分质量分数的HPLC测定方法。

1 仪器与试药

Agilent 1260 Infinity 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；二极管阵列检测器（美国安捷伦科技公司）；色谱柱为Agilent ZORBA×SB-C18StableBond Analytical 柱（4.6 mm ×250 mm，5µm）；AUW120D电子分析天平（日本岛津公司，精度为十万分之一）；PL-S30T 超声波清洗仪（东莞康士洁超声波科技有限公司）。

骨伤跌打康复凝胶贴膏剂（东莞市中医院制剂中心提供，批号分别为20230516、20230517、20230518、20230525、20230526、20230527、20230528、20230605、20230606、20230607）；原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、盐酸小檗碱、大黄酸、大黄素、大黄酚（中国食品药品检定研究院，批号分别为110809-201205、110885-201703、110773-201313、110713-201212、110721-201618、110756-201512、110796-201520）；乙腈、甲酸均为色谱纯（德国Merck公司）；甲醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取骨伤跌打康复凝胶贴膏，除去背衬及薄膜，精密称取凝胶膏剂20 g，加入甲醇40 mL，超声提取30 min，放至室温，称定质量，用甲醇补足减失质量，滤液离心（3 000 r/min，10 min），取上清液，置水浴锅中蒸干，用色谱甲醇充分溶解，定容至10 mL，摇匀，备用，使用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、盐酸小檗碱、大黄酸、大黄素、大黄酚适量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇制备成质量浓度为0.172、0.142、0.120、0.168、0.130、0.102、0.154 mg/mL 的混合对照品储备溶液。精密吸取适量混合对照品储备液，加甲醇定容至一定量程的容量瓶中，逐级稀释至不同质量浓度的混合对照品溶液，各成分质量浓度如下：原儿茶酸为172.0、68.8、51.6、34.4、17.2、8.6、3.44 μg/mL，咖啡酸为142.0、56.8、42.6、28.4、14.2、7.1、2.84 μg/mL，阿魏酸为120.0、48.0、36.0、24.0、12.0、6.0、2.4 μg/mL，盐酸小檗碱为168.0、67.2、50.4、33.6、16.8、8.4、3.36 μg/mL，大黄酸为130.0、52.0、39.0、26.0、13.0、6.5、2.6 μg/mL，大黄素为102.0、40.8、30.6、20.4、10.2、5.1、2.04 μg/mL，大黄酚为154.0、61.6、46.2、30.8、15.4、7.7、3.08 μg/mL。

2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBA×SB-C18StableBond Analytical（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；流速：1 mL/min；梯度洗脱（0～13 min，5%A～10%A；13%～15 min，10%A～12%A；15～30 min，12%A；30～32 min，12%A～15%A；32～33 min，15%A～20%A）；柱温：35 ℃；检测波长：290 nm；进样量：10 μL。

2.4 方法学考察[2−10]

2.4.1 专属性试验 取混合对照品溶液、供试品溶液、大黄阴性对照溶液（按处方取缺大黄的各味药材，按处方工艺制备大黄阴性样品，再按“2.1”项方法制备大黄阴性对照溶液）及黄柏阴性对照溶液（按处方取缺黄柏的各味药材，按处方工艺制备黄柏阴性样品，再按“2.1”项方法制备黄柏阴性对照溶液），分别按“2.3”项色谱条件进样，结果显示供试品溶液色谱图中相应位置上出现混合对照品色谱图上的原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、盐酸小檗碱、大黄酸、大黄素和大黄酚7 个成分峰；大黄阴性色谱图中，未检出大黄酸、大黄素、大黄酚；黄柏阴性色谱图中，未检出盐酸小檗碱。表明方法专属性良好，见图1－3。

图1 混合对照品（A）和供试品溶液（B）色谱图Figure 1 Chromatograms of mixed reference solution（A）and test solution（B）

图2 大黄阴性对照色谱图Figure 2 Negative control chromatogram of Radix et Rhizoma Rhei

图3 黄柏阴性色谱图Figure 3 Negative chromatogram of Cortex Phellodendri Chinensis

2.4.2 最低检测限（LOD）和定量限（LOQ） 取混合对照品溶液，依次稀释制成一系列梯度浓度的溶液，按“2.3”项色谱条件分别进样，取峰面积信噪比为1∶3左右，计算最低检测限浓度（LOD），取峰面积信噪比为1∶10 左右的浓度为最低定量限浓度（LOQ）。结果见表1。

表1 骨伤跌打康复凝胶贴膏剂中7 种主要成分的LOD和LOQTable 1 LOD and LOQ of seven main components of Gushang Dieda Kangfu Cataplasm

2.4.3 线性关系考察 将各质量浓度的混合对照品按“2.3”项色谱条件依次进样分析，以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，得到7种成分的回归方程及线性范围，见表2。可见，在设定的质量浓度范围内，7种成分的标准曲线线性关系良好，r＞0.999 0。

2.4.4 精密度试验 取同一份按“2.1”项下方法制备的供试品溶液（批号：20230516），按“2.3”项下色谱条件进样6 次，测得各成分峰面积RSD 分别为原儿茶酸1.26%、咖啡酸0.37%、阿魏酸0.75%、盐酸小檗碱0.88%、大黄酸2.54%、大黄素0.57%、大黄酚3.33%，各成分峰面积RSD 均小于5%；测得各成分保留时间RSD 分别为原儿茶酸0.58%、咖啡酸0.51%、阿魏酸0.17%、盐酸小檗碱0.04%、大黄酸0.04%、大黄素0.04%、大黄酚0.04%，各成分保留时间RSD均小于1%，表明仪器精密度良好。

2.4.5 稳定性试验 同一供试品溶液（批号：20230516）于制备后0、2、4、8、10、12 h，按“2.3”项下色谱条件进样，测得各成分峰面积RSD 分别为原儿茶酸2.78%、咖啡酸2.02%、阿魏酸0.04%、盐酸小檗碱1.92%、大黄酸0.53%、大黄素0.41%、大黄酚3.21%，各成分RSD 均小于3.5%；测得各成分保留时间RSD 分别为原儿茶酸1.50%、咖啡酸0.77%、阿魏酸0.13%、盐酸小檗碱0.29%、大黄酸0.16%、大黄素0.15%、大黄酚0.13%，各成分保留时间RSD 均小于2%，表明12 h内供试品溶液稳定性良好。

2.4.6 重复性试验 取6 份同一批号（20230516）的凝胶膏剂，按方法“2.1”项下方法制备成供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样分析，测得各成分峰面积RSD 分别为原儿茶酸6.11%、咖啡酸6.35%、阿魏酸5.27%、盐酸小檗碱7.17%、大黄酸5.44%、大黄素5.85%、大黄酚7.91%，各成分RSD 均小于10%；测得各成分保留时间RSD 分别为原儿茶酸0.36%、咖啡酸0.31%、阿魏酸0.10%、盐酸小檗碱0.147%、大黄酸0.02%、大黄素0.02%、大黄酚0.01%，各成分保留时间RSD均小于1%，表明该方法重复性良好。

2.4.7 加样回收率试验 取6 份同一批号（20230516）供试品约20 g，精密称定，精密加入已知含量的对照品溶液，按“2.1”项方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样，测定加样回收率，结果见表3。可见，原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、盐酸小檗碱、大黄酸、大黄素、大黄酚的平均回收率分别为93.79%、95.86%、96.12%、95.31%、96.58%、107.43%、97.12%，7 种成分的平均回收率均在93.79%～107.43%范围内。

表3 加样回收率试验结果Table 3 Results of recovery test

2.4.8 样品测定 取10 批样品按“2.1”项方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，平行测定3 次，记录峰面积，并计算样品含量，结果见表4。

表4 骨伤跌打康复凝胶贴膏剂中7种主成分的质量分数Table 4 Results of content determination for the seven main components of Gushang Dieda Kangfu Cataplasmw/（μg·g−1）

3 讨论

骨伤跌打康复凝胶贴膏剂7 种主要成分中，小檗碱主要存在于黄柏药材中；大黄酸、大黄素、大黄酚主要存在于大黄药材中；阿魏酸存在于当归尾、羌活药材中。研究过程中发现，黄柏阴性的色谱图仍检出阿魏酸，但阿魏酸峰高比供试品色谱图峰高低，可判断阿魏酸也来源于黄柏；咖啡酸在荆芥、泽兰和红花中存在；儿茶素在大黄、赤芍中存在。这些药材是骨伤跌打康复凝胶膏剂的主要药效成分，因此这7种成分的含量测定可以用于此制剂的质量控制。

预实验中，对样品制备的提取方法进行了考察，分别比较了水和甲醇作为提取溶剂时提取方式和提取时间的效果，结果显示用水提取的供试品溶液的色谱峰杂峰比较多，而甲醇超声30 min 提取制备出来的样品杂质比较少，色谱峰的重现性比较好。研究过程中还发现，制剂样品中的药粉粒度对成分含量均匀性和重现性的影响比较大，制剂制备的药粉粒度≥80 目，同一批次的水凝胶贴剂不同取样点的含量测定偏差比较大，样品的均匀性较差；制剂制备的药粉粒度≤100 目，同一批次的水凝胶贴剂含量测定结果偏差较小，均匀度比较好。因此制剂的药粉粒度要≤100 目。

由于骨伤跌打康复凝胶贴膏剂的处方成分比较多，建立的方法的检测时间较长，希望能继续改进色谱条件，缩短检测时间。课题组将继续进行该制剂的全成分分析，更好地阐释本制剂的有效成分和控制该制剂的产品质量。