不同产地拐枣七中10种微量元素的含量测定及分析

代木堂，邓诗风，刘丽荣，田臣，安正菊

（铜仁市中医医院药剂科，贵州 铜仁 554300）

拐枣七为罂粟壳植物荷青花Hylomecon japonica（Thunb.）Prantl et Kundig 的根和根茎，主要分布在川、陕、鄂地区，具有祛风除湿、通筋活络、散瘀消肿和止痛的作用，临床主要用于治疗风寒湿痹、风湿关节痛、跌打损伤、四肢乏力、胃脘痛等疾病[1−3]。拐枣七属于“太白七药”，质量标准收录于《陕西省药材标准（2015 年版）》[4]中。标准中对拐枣七仅采用薄层鉴别进行质量控制，未有其他质控指标。拐枣七的主要化学成分为生物碱类、皂苷类和酚酸类[5−7]，此外还有糖类和微量元素等。微量元素是植物生长中存在的一类必需元素，对植物的生长发育、新陈代谢都起着重要的作用[8−9]，不仅影响植物的生长，还会影响服药者的身体健康，因此对拐枣七中微量元素进行研究很有必要。大部分微量元素的质量分数较低，对分析方法的灵敏度和检出限要求较高，目前常用的检测方法有原子吸收光谱法、原子荧光光谱法和电感耦合等离子体发射光谱法等。电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）相较于上述方法，应用更加广泛，测定灵敏度高，且可以同时测定多种元素，大大缩短了测定时间、提高检测效率。

拐枣七中主要有K、B、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn 和Se 等10 种微量元素，且不同产地拐枣七中这10 种微量元素质量分数有差异，因此本试验确定选择其作为研究对象。本文参考相关文献报道[10−12]建立ICP-MS法同时测定18批次不同产地拐枣七药材中的10种微量元素，并对其进行聚类分析（HCA）和主成分分析，全面筛选出拐枣七中的主要特征元素，阐明不同元素之间的相关性，从而为系统全面地评价拐枣七药材的质量提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Nexlon350X 电感耦合等离子体质谱仪（美国PE 公司）；Muitiwav GO Plus 微波消解仪（美国Anton Paar 仪器公司）；OA-360 智能石墨赶酸仪（广州格丹纳仪器有限公司）；BSA124SCW 万分之一电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；100 μL、200 μL、1 mL可调式移液枪（德国Eppendorf公司）。

1.2 试药

K 单元素标准溶液，编号为GBW（E）083297；B单元素标准溶液，BWB2271-2016；Ca单元素标准溶液，GBW（E）083796；Na 单元素标准溶液，GBW（E）083295；Mg 单元素标准溶液，GBW（E）083299；Al单元素标准溶液，GBW（E）080219；Zn 单元素标准溶液，GBW（E）083393；Fe 单元素标准溶液，GBW（E）083395；Mn 单元素标准溶液，GBW（E）080263；Se 单元素标准溶液，GBW（E）080215，上述标准溶液质量浓度均为100 μg/mL；内标溶液（Ge 和In标准溶液），质量浓度为1 000 μg/mL，均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；KED 调谐液购自美国PE 公司；65%硝酸购自美国Merk 公司；水为超纯水，Millipore 超纯水机制备，电阻率≥18.3 MΩ/cm。

18批拐枣七药材均于近2年收集自铜仁市各中药材市场，且对药材标签和进货查验进行了确认，确保产地的准确性；另外，所有药材均经铜仁市中医医院药剂科安正菊副主任药师鉴定为罂粟壳植物荷青花Hylomecon japonica（Thunb.）Prantl et Kundig 的干燥根和根茎，为拐枣七药材正品。药材来源信息见表1。

表1 拐枣七药材的来源信息Table 1 Sources of H.japonica

2 方法与结果

2.1 ICP-MS条件

电感耦合等离子体质谱仪工作参数：RF射频功率为1 600 W，等离子体气体流量为22 L/min；辅助气体流量为1.8 L/min；雾化气流速为0.90 L/min；采样锥为Ni 锥，采样深度为7.0 mm，样品提升速率为1.0 L/min；液氩压力为0.7 MPa；脉冲电压为800 V；蠕动泵转速为40 r/min；样品冲洗为30 s；延迟为10 s；数据采集重复测定3次，测定时Ge和In元素作内标物质进行校正。

2.2 标准品溶液的制备

分别精密吸取上述多元素的混合标准溶液，用超纯水稀释制成每1 mL中分别含K 250、500、1 250、2 500、5 000、10 000 ng；B 25、50、125、250、500、1 000 ng；Ca 250、500、1 250、2 500、5 000、10 000 ng；Na 25、50、125、250、500、1 000 ng；Mg 25、50、125、250、500、1 000 ng；Al 100、200、500、1 000、2 000、4 000 ng；Zn 25、50、125、250、500、1 000 ng；Fe 100、200、500、1 000、2 000、4 000 ng；Mn 250、500、1 250、2 500、5 000、10 000 ng；Se 5、10、25、50、100、200 ng的系列标准溶液。

分别精密量取内标Ge 和In 元素标准溶液（1 000 μg/mL）各100 μL 置于100 mL 量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀，作为Ge 和In 对照品储备溶液（1 μg/mL），精密吸取Ge 和In 对照品储备溶液1 mL 置于10 mL 量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀，作为Ge和In标准品溶液（100 ng/mL）。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 供试品溶液的制备 取拐枣七药材粉碎，过2号筛，混匀备用。精密称取药材粉末0.5 g，置微波消解罐中，精密加入硝酸8 mL，混匀，置于微波消解仪内，按表2中的消解程序进行消解。消解完全后，取出消解管进行赶酸，酸挥发至约1～2 mL 时，用少量超纯水转移至聚四氟乙烯材料的50 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，即得供试品溶液。

表2 10种微量元素选择同位素和内标元素Table 2 Ten trace element selection isotopes and internal standard elements

表3 微波消解仪的工作条件Table 3 Working conditions of microwave digestion

2.3.2 空白溶液的制备 取微波消解罐，精密加入硝酸8 mL，混匀，置于微波消解仪内，按表2中的消解程序进行消解。消解完全后，取出消解管进行赶酸，酸挥发至约1～2 mL 时，用少量超纯水转移至聚四氟乙烯材料的50 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，即得空白溶液。

2.4 线性关系的考察

取“2.2”项下10 种元素系列混合标准溶液，按照“2.1”项下条件进行测定，内标进样管插入100 ng/mL 的内标溶液中，仪器的进样管插入质量浓度从低到高的各混合标准系列溶液中，每个样品测定3次，用3 次测定值的平均值作为纵坐标（Y），相对应的进样浓度作为横坐标（X），进行线性回归。计算得各元素的线性回归方程以及相关参数见表4。

表4 10种微量元素的线性方程、相关系数和线性范围Table 4 Linear equations，correlation coefficient，linearity of ten trace elements

2.5 精密度试验

取“2.2”项下10 种微量元素系列混合标准溶液，分别取K、B、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn 和Se 元素的中间质量浓度的混合标准溶液，按照“2.1”项下条件连续测定6 次，记录信号强度值，得K、B、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn 和Se 元素的RSD 值分别为1.08%、1.22%、2.17%、1.25%、2.33%、1.18%、2.76%、3.11%、1.58%、2.05%（n=6），均＜4%，表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性试验

取拐枣七药材（批号：210301）约500.0 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下条件进行测定，每个样品重复测定3 次，分别计算10种微量元素的质量分数，结果K、B、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn和Se元素的平均质量分数分别为16 520、10.24、222.60、862.40、1 660、36.68、55.36、70.21、46.35、0.102 2 mg/kg，RSD 分别为0.86%、1.27%、1.55%、1.33%、1.41%、2.55%、2.79%、3.37%、2.55%、3.35%（n=6），结果表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取拐枣七药材（批号：210301）约500.0 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件，分别于制备后0、1、2、4、8、12、16、20、24 h进样测定，记录信号测定值。结果K、B、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn 和Se 元素的RSD 分别为2.33%、2.62%、2.35%、3.17%、2.78%、3.55%、3.42%、2.95%、3.68%、3.96%（n=9），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

取拐枣七药材（批号：210301）粉末0.25 g，精密称定，制备6份。置于消解罐内，按照样品质量浓度加入相当的标准品溶液，按“2.3”项下方法分别制备供试品溶液、空白溶液，按“2.1”项下条件测定，按照外标法分别计算10种微量元素的加样回收率，结果各元素的平均回收率和RSD 值分别为K 97.14%、0.71%，B 104.87%、4.17%，Ca 97.08%、1.68%，Na 104.17%、1.49%，Mg 99.21%、1.30%，Al 104.62%、4.39%，Zn 98.46%、1.46%，Fe 95.25%、0.84%，Mn 95.92%、1.00%，Se 96.86%、4.73%。表明该方法的加样回收率良好。

2.9 检出限和定量限测定

取“2.3”项下的空白溶液，按“2.1”项下条件进行测定，连续测定11 次，计算空白溶液中K、B、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn 和Se 元素的标准偏差s，k为各元素标准曲线的斜率，以3s/k作为各元素的检出限，以10s/k作为各元素的定量限。结果K、B、Ca、Na、Mg、Al、Zn、Fe、Mn 和Se 元素的检出限分别为5.316、4.628、2.225、3.022、0.466、2.129、0.762、6.358、0.054、0.326 ng/mL；定量限分别为17.720、15.427、7.417、10.073、1.553、7.097、2.540、21.193、0.180、1.087 ng/mL。

2.10 样品质量分数测定

取18 批次拐角七药材，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下条件下测定（n=3），采用标准曲线分别计算出上述10 种微量元素的质量分数，结果见表5。

表5 拐枣七中10种微量元素的质量分数Table 5 The mass concentration of ten trace elements of H.japonica（n=3）w/（mg·kg−1）

2.11 聚类热图分析

聚类热图采用颜色对实验数据分布情况进行直观可视化的分析[13]，本研究对18 个不同产地的拐枣七药材中10 种微量元素的测定结果进行聚类热图分析。由于数据最高值和最低值差异较大，因此首先进行数据处理。由于Se 元素在多个产地的药材中均未检出，因此剔除Se 元素，将其他结果数据取对数后导入Hiplot在线数据可视化和分析平台（https：//hiplot.com.cn/），采用ward 方法，平均Euclidean距离为5时进行聚类，得到聚类热图见图1。图中颜色从蓝到红分别代表质量分数由低到高，18个不同产地的拐枣七药材可聚为三大类。其中陕西产拐枣七（编号为S1～S4）为第一类；湖北产拐枣七（编号为S8～S11）为第二类；四川产拐枣七（编号为S5～S7）、湖南产拐枣七（编号为S12～S13）、浙江产拐枣七（编号为S14～S15）和安徽产拐枣七（编号为S16～S18）为第三类。结果可直观体现除Se元素外的9 种元素中，K 元素质量分数最高，相同产地的微量元素质量分数相似度较高，不同产地之间差异较大。试验通过聚类分析将样品分为3 类，对研究拐枣七中微量元素质量分数和区分不同产地的拐枣七具有重要的意义，可为监测市售拐枣七药材的产地和评价拐枣七药材的药效作用提供技术参考。

图1 10种微量元素系统聚类分析结果Figure 1 Results of cluster analysis of ten trace elements

2.12 主成分分析

主成分分析（PCA）是一种将原来复杂的多变量进行降维，重新组合成一组新的变量信息[14]，通过少数几个代表性的新变量反映原始数据的大部分信息的分析方法。本试验采用Simca14.1 和SPSS20统计软件对上述18 个不同产地拐枣七药材中的10种微量元素测定结果进行PCA。由图2、表6可以看出前3 种成分的特征值大于1，累计贡献率达到92.462%，表明这3 种成分可以代表原始数据92.462%的变量信息，因此对其进行因子分析。由表7因子载荷矩阵和图3可以看出，第1个主成分因子中K、Ca、Na 的负荷量较大，第2 个主成分因子中Al、Mn的负荷量较大，第3个主成分因子中Mg的负载荷量较大，因此可以确定拐枣七中的K、Ca、Na、Mg、Al和Mn为主要特征微量元素。

图2 18批样品中10种微量元素的PCA得分图Figure 2 The PCA score plot of ten trace elements of 18 batches of samples

图3 10种微量元素的主成分分析碎石图Figure 3 The gravel plot of principal component analysis of 10 trace elements

表6 主成分的初始特征值和方差贡献率Table 6 Initial eigenvalue and variance contribution rate of principal components

表7 3种主成分的因子载荷矩阵Table 7 Factor loading matrix of three principal components

3 讨论

拐枣七药材中含有多种微量元素，微量元素不仅参与植物的生理代谢，也是植物次生代谢产物的构成因子，其元素的种类和质量分数对中药的临床药效发挥具有一定的作用[15]，因此微量元素也可以作为中药质量评价的重要指标之一。目前微量元素的测定主要采用原子吸收光谱法，原子吸收测定较慢，且由于不同产地的药材所含微量元素质量分数存在差异，每种元素都需要可发射特定波长的灯，且只能逐个测定，这就导致测定效率较低、耗时较长。电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）在多种元素的测定中具有较大优势，可以同时测定且分析速度快、灵敏度和准确度较高，因此可以用于中药材中多种微量元素的同时测定。

本研究测定18 个不同产地拐枣七药材中10 种微量元素的质量分数，并采用PCA 对其进行综合评价，结果发现不同产地拐枣七中微量元素质量分数差异较大，而相同省份拐枣七中微量元素差异较小。湖北蕲州镇产的拐枣七中K、Ca、Na 和Fe 质量分数均高于其他地区；Se 元素仅在陕西省四县及浙江省两市的药材中有检出，其他产地均未检出；K、Na 和Mg 3 种元素的质量分数远高于其他元素，K 元素最高质量分数达到37 032 mg/kg，Mg 元素为2 904 mg/kg，Na 元素为2 604 mg/kg。分析可能因为K 是植物生长的必需元素，可增强光合作用，维持细胞的正常含水量，提高植物的抗旱和缺寒能力；Mg是构成叶绿素的主要元素；Na是植物生长的功能性元素，对植物的生长具有刺激作用[16]；且这3种元素在植物生长中发挥主要作用。由于其质量分数较高，在测定时对供试品溶液进行了2次稀释，保证样品所测值在线性范围及结果的准确性。不同产地微量元素质量分数的差异可能与当地的土壤、气候以及生态环境有关，因此评价药材质量的优劣需要综合考虑。

目前，市售中药材存在问题较多，主要有混杂、质量退化、造假等。本试验建立了ICP-MS 法同时测定不同产地18批次拐枣七中K、Ca、Na等10种微量元素含量的分析方法。试验选取了不同省份产的18批次拐枣七药材作为研究对象，运用本试验建立的方法检测上述拐枣七药材中10 种微量元素的质量分数，并通过聚类分析研究不同产地拐枣七药材中K、Ca、Na 等10 种微量元素质量分数的差异。通过此研究，为监测市售拐枣七药材的产地、评价拐枣七药材的质量水平提供了技术参考。