白藜芦醇通过miR-512-3P/DUSP1轴抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的自噬并促进细胞凋亡

孙正杨,刘楠楠,范学菲,陈苏环,陈唔奇,陈广祎,邵玉宝,陈晓宇,

(1.安徽医科大学组织胚胎学教研室,安徽 合肥 230032;2. 中国科技大学医院眼科,安徽 合肥 230002;安徽医科大学 3.临床医学系、4.形态学实验中心, 安徽 合肥 230032)

葡萄膜黑色素瘤是一种严重的眼部癌症,起源于葡萄膜的黑色素细胞,是成人致死率较高的眼部肿瘤[1]。白藜芦醇(resveratrol,RES)是一种类黄酮多酚化合物,具有改善代谢和免疫功能,保护心肌细胞,且在抗肿瘤中具有显著的效果[2],有报道RES对黑色素瘤也具有一定的治疗效果[3-4]。miRNA(microRNA)是一类非编码RNA分子,miRNA的异常表达与多种疾病有关。前期研究发现[5],miR-512-3P在肿瘤组织中表达减低,而在RES治疗后明显增加。双特异性磷酸酶1(dual specificity phosphatase 1,DUSP1)具有调节细胞信号通路转导的作用[6],在炎症、免疫应答、癌症等许多疾病中扮演重要角色。本研究旨在探究RES抑制葡萄膜黑色素瘤细胞(choroidal melanoma cells,MUM2B)自噬并促进其凋亡的调控作用及机制,为葡萄膜黑色素瘤寻找新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞与试剂 侵袭性MUM2B购自美国典型生物资源保藏中心(ATCC,Rockville,MD,USA)。RES(R5010,分子量228.24),购自美国Sigma公司;DMEM(10569-010),购自美国Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(04-001-1ACS),购自美国BI公司; Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒(BB-41012-3),购自上海贝博生物公司;CCK-8试剂盒(C0037),SYBR Green QPCR master mix(D7260),Hoechst 33342活细胞染色液(C1027),购自碧云天生物有限公司; mimic,购自擎科生物科技有限公司;Lipo2000(CN2483146),购自美国Thermo Fisher Scientific公司; RNA提取试剂盒(A4A0978),购自湖南AG生物科技有限公司。Epha2(bs-0485R),E-cadherin(bs-4310R)购自北京博奥森生物科技有限公司;ERK(WL01864),p-ERK(WLP1512),购自沈阳万类生物科技有限公司;β-actin(ab8226),购自美国Abcam公司; AGO2(67934-1- Ig),购自武汉三鹰生物科技有限公司; LC3A / B(12741),p62(16177S),购自美国CST公司;p-mTOR(T56571),Bcl2(ab182858),Caspase3(T40044),购自上海艾比玛特生物科技有限公司;Bax(YT0455),购自美国ImmunoWay公司。

1.1.2仪器 MultikanFC型酶标仪(美国赛默飞世尔公司);激光八色流式细胞仪(美国BD公司)Thermo Forma4111 CO2恒温培养箱(美国热电公司);LEICA.SP5-DMI6000-DIC共聚焦显微镜(德国Leica公司);蛋白电泳仪、蛋白转膜仪、凝胶成像系统(北京六一仪器厂);TS2R-FL荧光倒置显微镜(日本尼康公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与处理 MUM2B在Dulbecco的改良Eagle培养基中培养,内有10%胎牛血清和1%抗生素。将细胞在含5% CO2的37 ℃培养箱培养。使用Lipo2000将mimic转染到MUM2B细胞中,然后将细胞用于后续实验。

1.2.2细胞划痕实验 首先使用 marker 笔在 6 孔板背后,用直尺比着,均匀的划横线,大约每隔 0.5～1 cm 一道,横穿过孔。在孔中加入约5×105个细胞。第二天用枪头垂直与细胞平面,沿着前一天划在平板背面的线在细胞层上进行划痕。划痕完成后,将细胞放入 37 ℃、5% CO2培养箱培养。然后在0 h和24 h取出细胞,显微镜线观察并测量划痕的宽度,并拍照。使用 ImageJ随机划取6～8条水平线,计算细胞间距离的均值。

1.2.3CCK-8检测 收获对数生长期的MUM2B细胞,以每孔1×106L-1的密度接种于96孔板,边缘孔用PBS填充,5% CO2、37 ℃孵育至细胞贴壁。转染24 h后,向每孔加入10 μL CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育1～4 h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.2.4生信分析 通过GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)获取数据集GSE163942,并通过GEO数据库在线分析工具GEO2R进行差异基因分析,筛选logFC>1或logFC<-1,P<0.05为差异基因。使用miRDB预测miR-512-3p与DUSP1的靶向结合。

1.2.5Western blot 使用制备的SDS裂解缓冲液从细胞中提取总蛋白,用于蛋白质印迹分析。然后,使用60% SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质并印迹到聚偏二氟乙烯膜上。然后将膜在5%脱脂牛奶中密封1.5 h。加入相应一抗在4 ℃孵育过夜,然后加入HRP标记的二抗孵育1 h,并通过ECL发光系统检测免疫反应。

1.2.6qRT-PCR 采用RNA提取试剂盒提取细胞RNA,采用紫外分光光度计检测RNA浓度,置-80 ℃保存备用。采用SYBR Green QPCR master mix检测RNA的表达。以β-actin为内参对照,取平均CT值(扩增动力曲线拐点),按2-△△CT进行半定量分析,计算目的基因相对表达量。引物序列见Tab 1。

1.2.7Hochest33342染色 弃去培养基,PBS洗2遍,滴加适量的Hoechst33342活细胞染色液,轻柔混匀。在适宜于细胞培养的温度孵育10 min。吸除染液,用培养液或PBS洗涤2～3次,在荧光显微镜下观察。

1.2.8Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡 将细胞按5×108L-1的密度接种到6孔板培养24 h,转染mimic。加入0.25%的胰酶溶液(不含EDTA)消化细胞,经过PBS冲洗,离心,加入100 μL缓冲液使细胞重悬。然后加入5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI于室温避光解育15 min。随后加入400 μL缓冲液,采用流式细胞仪测定细胞调亡状况。

1.2.9RIP实验 RIP用于验证miR-512-3p与DUSP1之间的结合关系。将全细胞裂解物与含有与抗Ago2抗体偶联磁珠的RIP缓冲液一起在4 ℃孵育过夜,免疫球蛋白G(IgG)用作阴性对照。洗涤磁珠,提取RNA。通过qRT-PCR对共沉淀RNA进行评估。

2 结果

2.1 RES激活ERK通路抑制葡萄膜黑色素瘤的增殖与侵袭为研究RES在抑制MUM2B增殖与侵袭中作用,我们使用不同浓度RES(0、10、20、40、60、80 μmol·L-1)处理MUM2B细胞,划痕实验检测细胞迁移,CCK-8检测细胞活力,结果表明,高浓度RES(60、80 μmol·L-1)可以明显抑制MUM2B的迁移与细胞活力(Fig 1A,B)。Western blot实验结果表明,RES抑制了Epha2与E-cadherin蛋白表达(Fig 1C)。qRT-PCR结果表明,高浓度RES抑制MUM2BMMP2、MMP9、E-cadherin、PCNA、Epha2的RNA表达(Fig 1D)。此外RES还激活了ERK通路的表达(Fig 1E)。因此,RES通过激活ERK通路参与抑制葡萄膜黑色素瘤的侵袭与增殖。

2.2 RES通抑制MUM2B的自噬促进其凋亡为探究RES治疗后MUM2B中自噬与凋亡的关系,我们使用不同浓度RES处理细胞,Western blot结果表明,P62大量蓄积,LC3B表达减少,Bax和Caspase3剪切体蛋白表达增多,Bcl2蛋白表达减少(Fig 2A,B)。然后使用不同浓度雷帕霉素处理经RES治疗后的MUM2B,Western blot检测自噬与凋亡蛋白表达,结果表明,雷帕霉素激活了细胞自噬,抑制了RES导致的细胞凋亡(Fig 2C,D)。上述结果表明,RES可能通过抑制MUM2B的自噬促进细胞凋亡。

2.3 RES通过促进miR-512-3p的表达靶向抑制DUSP1为进一步探究RES治疗葡萄膜黑色素瘤的内在机制,我们通过qRT-PCR检测,发现miR-512-3p在RES治疗的MUM2B中高表达(Fig 3A)。通过生信分析与数据库预测到miR-512-3p在MUM2B中低表达并且与DUSP1存在靶向结合位点(Fig 3B)。通过RIP实验证明miR-512-3P能够与AGO2形成沉默复合体靶向降解DUSP1(Fig 3C)。此外,过表达miR-512-3p抑制了DUSP1的表达(Fig 3D),并且Western blot结果显示,RES抑制了MUM2B中DUSP1蛋白的表达(Fig 3E)。以上结果表明,RES通过促进miR-512-3p的表达靶向抑制DUSP1,从而参与抑制MUM2B的发生发展。

2.4 miR-512-3p抑制了MUM2B的增殖并促进其凋亡为进一步探究miR-512-3p在MUM2B中发挥的功能,我们过表达了miR-512-3p,qRT-PCR检测E-Cadherin和Vim的RNA表达,结果表明,过表达miR-512-3p抑制了MUM2B的增殖(Fig 4A)。此外通过qRT-PCR检测Bax、Bcl2的表达,通过Hochest33342与流式检测细胞凋亡,结果表明,过表达miR-512-3p促进了MUM2B的凋亡抑制了细胞增殖(Fig 4B,C,D)。

3 讨论

葡萄膜黑色素瘤也称脉络膜黑色素瘤,其具有非常强的转移侵袭能力,且转移后预后极差。当前对葡萄膜黑色素瘤的治疗方法的研究多集中在免疫疗法[7-8]。近年来,随着对天然化合物的研究不断增多,发现它们不仅对免疫性疾病、神经退行性疾病有着显著治疗效果,同时也能有效抑制肿瘤的发生发展[9]。在本研究中,我们发现RES能够有效抑制MUM2B的增殖与侵袭,并且减少了MUM2B的氧化水平,此外,RES还通过抑制细胞自噬促进了MUM2B的凋亡。RES是一种类黄酮多酚化合物,具有良好的抗炎抗氧化以及抗肿瘤的作用,对黑色素瘤有一定的治疗效果。本研究中我们发现RES能够抑制MUM2B的增殖与侵袭。RES通过激活ERK通路,抑制MUM2B的自噬,并且促进了细胞凋亡,此外RES通过增加miR-512-3p的表达,抑制了DUSP1的表达,促进了ERK通路的激活。

miRNA是一类短小非编码RNA分子,与肿瘤之间存在紧密的关系,可以作为肿瘤的潜在治疗靶点或预测标志物。研究发现,miR-512-3p在肝癌细胞中有明显的差异表达[10]。并且miR-512-3p还通过CDCA3参与三阴乳腺癌的调控[11]。我们研究中发现miR-512-3p在葡萄膜黑色素瘤中低表达,而在RES治疗后出高表达,并且过表达miR-512-3p明细促进了MUM2B的凋亡抑制了细胞增殖。

DUSP1是一种拥有磷酸酯酶活性的蛋白质,它在细胞内参与调控多种信号通路。DUSP1可以通过去磷酸化MAPK从而抑制细胞增殖和促进细胞凋亡,进而对肿瘤的生长和转移产生抑制作用[12]。在本研究中,我们发现DUSP1在MUM2B中高表达,而在RES治疗后出现下降,并且抑制了MUM2B的凋亡。

本研究探讨了RES治疗葡萄膜黑色素瘤具有可行性的证据,RES可以通过ERK通路抑制细胞自噬促进其凋亡。此外,本研究阐明了RES通过miR-512-3P/DUSP1轴调控MUM2B自噬与凋亡的内在机制。为寻找葡萄膜黑色素瘤治疗的新靶点提供了理论依据。

Fig 1 Resveratrol activated ERK pathway to inhibit proliferation and invasion of uveal melanoma

Fig 2 Resveratrol inhibited autophagy and promoted apoptosis in uveal melanoma cells

Fig 3 Resveratrol targeted and inhibited DUSP1 by promoting miR-512-3p expression

Fig 4 miR-512-3p inhibited proliferation and promoted apoptosis in uveal melanoma cells