miR156 调控猕猴桃果实抗坏血酸代谢机制初探

周钰雯，陈 超，胡晶金，周雨菲，陈思懿，李 旭，*

（1.浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100；2.宁波大学科学技术学院/宁波市农业种质资源挖掘与环境调控重点实验室，浙江 宁波 315212；3.慈溪市坎墩玉兰果蔬农场，浙江 宁波 315300）

抗坏血酸（L-ascorbic acid，AsA），又名维生素C，是广泛存在于植物中的小分子抗氧化物质[1]，对植物的生长发育及果实品质的形成具有重要作用，也是维持人类正常生长发育所必需的营养物质[2]。因此，提高果蔬中AsA 含量具有重要的产业意义和应用价值。

猕猴桃是猕猴桃科猕猴桃属中多年生落叶藤本植物，果实中AsA 含量是梨和苹果的80～100 倍，享有“水果之王”“VC 之王”的称号[3]。AsA 高效代谢积累成为猕猴桃果实营养物质的研究热点。相关研究表明，猕猴桃AsA 生物合成途径中AcPMM、AcGME2和AcGalLDH基因，循环途径中AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR和AcAPX基因是调控红阳猕猴桃果实高AsA 水平的重要基因[4]。猕猴桃果实内外果皮AsA 含量存在显著差异[5-6]，内果皮AsA 含量显著大于外果皮，然而内外果皮AsA 差异的生理和分子机制尚不清楚。因此，本研究通过生理生化以及转基因手段，探究猕猴桃内外果皮AsA 代谢差异的原因。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以红阳猕猴桃果实为试材，采样时间为2022 年5—9 月，于盛花期后40 d 开始，每隔20 d 采样1 次，选取大小均匀的无损伤猕猴桃果实，果实分内外果皮，于液氮中磨至粉状，放入-80 ℃冰箱中保存，用于测定AsA 含量和基因表达量。

1.2 AsA和T-AsA含量的测定

T-AsA 即总抗坏血酸。AsA 和T-AsA 的提取与测定参照张琰等[7]的方法进行。

1.3 总RNA提取及反转录cDNA的合成

称取约0.1 g 猕猴桃果实（分内、外果皮），使用植物RNA 提取试剂盒来提取果实内外果皮总RNA。根据反转录试剂盒说明书进行操作。

1.4 小RNA提取及反转录

小RNA 提取采用Takara 公司的RNAiso for Small RNA（9753A，Takara，大连，中国）试剂进行提取。采用茎环法设计猕猴桃miR156 和5S rRNA 的反转录茎环引物和半定量引物[8]，反转录cDNA，通过实时荧光定量检测miR156 表达量。

1.5 实时荧光定量PCR

采用三步法进行q-PCR 扩增。以猕猴桃AcActin作为内参基因，设置3 个生物学重复，每个基因的相对表达量以2（-ΔCT）方法进行分析。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃果实内外果皮AsA和T-AsA含量差异分析

如图1 所示，在幼果时期（盛花后40 d），AsA、T-AsA 含量达到最高值，之后随着果实的生长发育逐渐下降。果实内果皮AsA 含量在花后100 d 趋于稳定，而果实外果皮中AsA 含量在花后80 d 已无明显变化。花后120 d（商业化成熟期）时，内、外果皮中AsA 的含量分别为花后40 d 的29.2%和22.7%。综上所述，猕猴桃果实发育过程抗坏血酸含量逐渐降低，果实内果皮抗坏血酸含量显著大于外果皮。

图1 猕猴桃果实内外果皮AsA 和T-AsA 含量变化

2.2 猕猴桃果实内外果皮AsA合成途径相关基因表达变化分析

根据前期测定的转录组数据，筛选获得AsA 合成途径的基因，采用荧光定量PCR 技术，分析6 个AsA合成途径基因的表达情况。如图2 所示，在果实生长发育过程，合成基因与AsA 含量水平呈现相似的变化趋势。果实发育早期即花后40～60 d，果实内果皮中AsA 合成基因转录水平显著高于外果皮。综上研究结果表明，在AsA 合成途径中，AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGalLDH、AcGME是导致猕猴桃果实内外果皮AsA 含量差异的关键基因且在果实发育早期差异显著。

图2 猕猴桃果实内外果皮AsA 合成途径基因表达

2.3 猕猴桃果实内外果皮AsA循环途径相关基因表达变化分析

在猕猴桃果实发育的过程，AsA 循环途径相关基因AcMDHAR1、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR整体上呈现下降趋势。果实发育后期即花后80～120 d，果实内果皮中AsA 循环途径基因表达水平显著高于外果皮（见图3）。综上表明，在AsA 循环途径中，AcMDHAR1、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR是导致猕猴桃果实内外果皮AsA 差异的主要基因且在果实发育后期差异显著。

图3 猕猴桃果实内外果皮AsA 循环途径基因表达

2.4 猕猴桃果实内外果皮miR156表达变化分析

荧光定量PCR 结果显示（见图4），miR156 基因的表达水平整体呈下降趋势，且在整个生长过程中，果实内果皮中miR156 基因含量显著高于外果皮，在花后120 d 趋于平衡。综上，猕猴桃果实发育过程miR156 基因的表达和抗坏血酸含量变化基本一致。

图4 猕猴桃果实生长过程miR156 表达

2.5 转基因验证miR156对猕猴桃果实抗坏血酸含量的影响

为了验证miR156 基因对猕猴桃果实抗坏血酸含量的影响，通过瞬时转化猕猴桃果实手段进行验证分析。如图5(a)所示，35S:MIR156a过表达猕猴桃果实中miR156 表达水平显著升高，35S:MIM156干扰表达果实中miR156 表达水平显著降低。如图5(b)—(c)所示，与对照组相比，T-AsA 和AsA 含量在35S:MIR156a过表达猕猴桃果实中显著增加，而在35S:MIM156干扰表达果实中显著减少。综上，miR156 基因正调控猕猴桃果实中的抗坏血酸含量。

图5 miR156 对猕猴桃果实抗坏血酸含量的影响

2.6 miR156对抗坏血酸合成和循环途径基因表达的影响

为了进一步验证miR156 基因对抗坏血酸的调控作用，利用实时荧光定量PCR 技术测定分析AsA 合成和循环途径相关基因表达水平。如图6 所示，与对照组相比，在35S:MIR156a过表达果实中，AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGaILDH、AcGME、AcMDHARI、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR表达水平显著升高，而在35S:MIM156干扰表达果实中上述基因的表达水平显著下降，但AcPMM表达水平几乎不变。综上，miR156 调控猕猴桃果实中的抗坏血酸合成和循环途径基因表达。

图6 miR156 对抗坏血酸合成和循环途径基因表达的影响

3 讨论与结论

猕猴桃果实果实发育过程中，AsA 在幼果时期含量达到最高值，之后随着果实发育快速下降，这与钟彩虹等研究结果基本一致。荧光定量PCR 结果表明，果实内果皮miR156 基因表达量显著高于外果皮。已有研究表明，miR156-SPL 不仅是调控植物幼年到成年阶段转变的核心分子模块，还参与植物生长发育其他方面，如植株形态建成、质体转化、生殖发育、果实成熟和胁迫响应等[9]。本研究初步结果明确miR156对AsA 代谢具有调控作用，说明miR156-SPL 分子模块功能比较丰富。

本研究发现，猕猴桃果实内果皮AsA 含量显著高于外果皮。在AsA 合成途径中，AcPGI、AcPMM、AcGMP、AcGPP、AcGalLDH、AcGME是导致猕猴桃果实内外果皮AsA 差异的主要基因且差异主要存在于果实发育早期。在AsA 循环途径中，AcMDHAR1、AcMDHAR2、AcDHAR、AcGR是导致猕猴桃果实内外果皮AsA 差异的主要基因且差异主要存在于猕猴桃果实发育后期，降解途径未见差异。瞬时转基因手段证实miR156 调控猕猴桃果实中的抗坏血酸合成和循环途径基因表达。