黄芪抑制胶质瘤的作用机制和基因靶点研究

陈潘迪 王洪财 李振强 王东峰 叶耿帆 陈茂送

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，占颅内肿瘤的35%～61%，具有发病率高、治愈率低的特点。根据胶质瘤恶性程度，WHO 将其分为4 个级别：生长缓慢、较少发生恶性转化的毛细胞性星形细胞瘤为Ⅰ级；弥漫性浸润性星形细胞瘤为Ⅱ级；间变性星形细胞瘤为Ⅲ级；胶质母细胞瘤为Ⅳ级[1]。目前治疗胶质瘤的方法主要有手术、放疗、化疗、免疫治疗、电场治疗等，但治疗效果不佳，患者预后和生存不理想[2]。因此，寻找一种高效、低毒、有效的新型治疗方法是当前研究的热点。黄芪已被广泛应用于免疫调节、抗氧化等方面的临床治疗。近年来研究发现，黄芪具有抑制肿瘤细胞分裂增殖的作用[3-5]。此外，黄芪还能增强免疫功能[6]，促进机体免疫抗肿瘤反应，但是具体作用机制尚不清楚。因此，本研究基于网络药理学预测黄芪抑制胶质瘤的作用机制和基因靶点，并通过细胞实验进一步验证，以期为临床开发和利用黄芪治疗胶质瘤提供依据。

1 材料和方法

1.1 基于网络药理学分析

1.1.1 黄芪的主要生物活性成分及药物作用基因靶点筛选 利用中药系统药理学TCMSP v2.3 数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[7]，以“黄芪”为关键词检索到黄芪的所有生物活性成分，再设置筛选主要生物活性成分的条件为口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药比（drug-likeliss，DL）≥0.18。同时在TCMSP v2.3 数据库检索主要生物活性成分的蛋白质靶点，并通过STRING 数据库（https://cn.string-db.org/）[8]转化为基因符号，即药物作用基因靶点。

1.1.2 胶质瘤相关的人类基因筛选 利用GeneCards数据库[9]，以“胶质瘤”为关键词检索并导出胶质瘤相关的人类基因，筛选出Relevance≥2 倍score 中位数的基因；再利用OMIM数据库检索胶质瘤相关的人类基因[10]；两者合并消除重叠后，最终获得胶质瘤相关的人类基因。

1.1.3 黄芪在胶质瘤中的基因靶点识别 利用R 语言将黄芪的药物作用基因靶点与胶质瘤相关的基因进行比对分析并取交集，筛选出重叠的基因靶点，得到黄芪可能治疗胶质瘤的基因靶点数据。再利用UNIPROT 数据库将上述基因靶点转换成标准的UNIPROT ID 作进一步分析[11]。

1.1.4 基因本体论（gene ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析 利用DAVID 数据库对靶点基因进行GO 富集分析[12]，内容包括生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。再行KEGG 通路分析，筛选出P＜0.05 的通路作进一步分析。

1.1.5 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建 为明确靶点间的相互关系，将前期得到的黄芪可能治疗胶质瘤的基因靶点数据提交至STRING 数据库，设定生物种类为“Homo sapiens”，将“Settings”中 的“minimum required interaction score”选为“highest confidence（0.900）”，其余均为默认设置，剔除游离无联系基因，分析获得PPI 网络。

1.1.6 Hub 基因筛选 将上述PPI 网络数据导入Cytoscape 3.9.1 软件[13]，利用CytoHubba 插件中的MCC 算法计算并筛选黄芪治疗胶质瘤的前10 位核心基因，即Hub 基因。

1.1.7 疾病-药物-成分-靶点-通路的可视化网络构建 将上述分析得到的靶点、通路、成分数据导入Cytoscape 3.9.1 软件，删除无联系基因，构建疾病-药物-成分-靶点-通路的可视化网络图，并使用插件Network Analyzer 分析其网络特征。

1.2 细胞实验论证

1.2.1 主要材料 胶质瘤细胞株U251（批号：CL-0237）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。黄芪（干药材）由宁波市医疗中心李惠利医院中医科提供。PBS（批号：21-040-CVC）购自美国Corning 公司；胰蛋白酶（含0.25%乙二胺四乙酸）（批号：25200056）、DMEM 细胞培养基（批号：11965092）、FBS（批号：10099）均购自美国Gibco 公司；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）（批号：CK04）购自日本同仁化学公司；活死细胞双染色试剂盒（批号：KTA1001）购自Abbkine 生物技术有限公司。

1.2.2 细胞培养及传代 将含有1 mL U251 细胞悬液的冻存管置于37 ℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5 mL含10% FBS 的DMEM 培养基混合均匀。1 000 r/min 离心5 min，弃上清液，补加5 mL 完全培养基后吹匀；再将所有细胞悬液加入培养瓶中，置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养过夜。当细胞密度达80%～90%时进行传代培养，取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.3 黄芪培养液的制备 将60 g 黄芪研磨后置于700 mL 蒸馏水中浸泡30 min，然后煎煮1 h，汤液经24目药典筛（孔径0.85 mm）过滤，药渣按照上诉步骤重复操作2次。将3次药液混合，浓缩至50 mL，4 000 r/min离心30 min 去除杂质，收集上清液，并用0.22 μm 孔径的微孔滤膜器滤菌，添加蒸馏水至60 mL，得到1 g/mL的无菌黄芪提取液，储存于-20 ℃冰箱内备用。使用时，将黄芪提取液分装并用完全培养基配置成浓度为1、5、10 mg/mL 的黄芪培养液。

1.2.4 黄芪对U251 细胞存活率的影响检测 采用CCK-8 法。将U251 细胞调整密度至1×105/L，铺于96孔板中，放在37 ℃、含5% CO2的培养箱中过夜培养。吸去旧培养液，分别加入浓度为1、5、10 mg/mL 的黄芪培养液作为实验组（设为1 mg/mL 组、5 mg/mL 组、10 mg/mL 组），加入完全培养基作为对照组。培养24、48、72 h 后加入CCK-8，在培养箱中继续孵育2 h；使用酶标仪检测波长450 nm 处（参照波长630 nm）的吸光度（absorbance，A），计算细胞存活率。细胞存活率=（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%，其中空白组只含CCK-8，不含细胞和培养液。

1.2.5 黄芪对U251 细胞凋亡的影响检测 采用活死细胞双染色法。将U251 细胞铺于24 孔板中，置于37 ℃、含5% CO2的培养箱中过夜培养。分别加入浓度为1、5、10 mg/mL 的黄芪培养液作为实验组（设为1 mg/mL 组、5 mg/mL 组、10 mg/mL 组），加入完全培养基作为对照组，继续培养48 h。根据活死细胞双染色试剂盒说明书配置0.5 mL 染色溶液并加入细胞中，于黑暗中37 ℃条件下孵育30 min，PBS 清洗2 次。在显微镜下分别拍摄活死细胞的荧光图并进行融合观察。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 9.0 统计软件。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基于网络药理学分析结果

2.1.1 黄芪的主要生物活性成分及药物作用基因靶点 共检索得到87 种黄芪成分，其中20 种（23.0%）符合OB≥30%且DL≥0.18，见表1。在TCMSP v2.3 数据库中检索这20 种主要生物活性成分，共得到462 个蛋白质靶点，经SRTING 数据库转化为基因符号后得到420个药物作用基因靶点。

2.1.2 黄芪在胶质瘤中的基因靶点筛选与识别 共获得胶质瘤相关的人类基因1 144 个。将420 个黄芪的药物作用基因靶点与胶质瘤相关的人类基因进行比对分析，最终筛选出145 个黄芪可能治疗胶质瘤的基因靶点。

2.1.3 基因靶点的GO 富集分析 145 个基因靶点经GO 富集分析后得到740 个BP、88 个CC、145 个MF，其中最主要的生物学功能包括不同蛋白结合、相同蛋白结合、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控、酶结合等，见图1（插页）。

图1 基因本体论富集分析结果

2.1.4 基因靶点的KEGG 通路分析 145 个基因靶点经KEGG 通路分析后得到信号通路168 条，其中最主要的信号通路包括癌症通路、脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、化学致癌-受体激活等，见图2（插页）。

图2 京都基因和基因组数据库富集分析结果

2.1.5 PPI 网络构建与Hub 基因筛选 PPI 网络见图3。Hub基因关联程度从高到低依次为血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）A、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）1、JUN、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）9、PTGS2、IL-6、IL-1B、CASP3、TP53、HIF1A，见图4。

图3 蛋白质-蛋白质相互作用网络图

图4 Hub 基因

2.1.6 疾病-药物-成分-靶点-通路的可视化网络构建 疾病-药物-成分-靶点-通路的可视化网络见图5（插页）。在所有生物活性成分中，MOL000098（槲皮素）的度值最高，为118；在所有信号通路中，hsa05200（癌症通路）的度值最高，为61；在所有基因靶点中，AKT1、RELA、PTGS2、MAPL1、TP53 的度值较高，分别为21、20、20、19、18，在黄芪治疗胶质瘤过程中可能起重要作用。

图5 疾病-药物-成分-靶点-通路的可视化网络构建

2.2 细胞实验论证结果

2.2.1 不同浓度黄芪培养液对U251 细胞存活率的影响 培养24 h 时，5 mg/mL 组、10 mg/mL 组细胞存活率较对照组、1 mg/mL 组均明显降低（均P＜0.05）；培养48、72 h 时，1 mg/mL 组、5 mg/mL 组、10 mg/mL 组细胞存活率较对照组均明显降低（均P＜0.05），5 mg/mL组、10 mg/mL 组细胞存活率较1 mg/mL 组均明显降低（均P＜0.05），10 mg/mL 组细胞存活率较5 mg/mL 组均明显降低（均P＜0.05），见图6。

图6 不同浓度黄芪培养液对U251 细胞存活率的影响

2.2.2 不同浓度黄芪培养液对U251 细胞凋亡的影响黄芪对U251 细胞具有一定的凋亡作用，且随着黄芪培养液浓度的增加，凋亡细胞明显增多，见图7（插页）。

图7 不同浓度黄芪培养液对U251 细胞凋亡的影响

3 讨论

黄芪是临床上常用的一味中药，具有抗菌消炎、解毒等功效[14-15]。近年来研究发现，黄芪还具有抑制肿瘤细胞分裂与增殖的作用[3-5]。有体外实验结果表明，黄芪可以抑制胶质瘤细胞增殖并诱导胶质瘤细胞凋亡[16]，但是具体作用机制如何尚不清楚。因此，本研究基于网络药理学作一分析，并通过细胞实验作进一步验证。

网络药理学作为一种新兴的药物研发策略，在药物发现、机制研究和临床应用等方面均有广阔的应用前景。但是，基于网络药理学分析的结果受数据来源的影响较大，因此需要对数据的质量作进一步严格的评估和筛选，对结果进行多次验证和重复性分析。本研究基于网络药理学分析共筛选出145 个黄芪可能治疗胶质瘤的基因靶点，包括AKT1、RELA、PTGS2、MAPL1、TP53 等关键基因，这些基因可能在生物学过程中发挥核心作用。GO 富集分析显示，这些关键基因主要通过不同蛋白结合、相同蛋白结合、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控、酶结合等生物学功能发挥作用。KEGG 通路分析显示，这些关键基因调控多个信号通路来发挥药物作用，主要包括癌症通路、脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、化学致癌-受体激活等。进一步构建PPI 网络，利用MCC 算法分析得到Hub 基因，主要包括VEGFA、AKT1、JUN、MMP9、PTGS2、IL-6、IL-1B、CASP3、TP53、HIF1A。最后构建疾病-药物-成分-靶点-通路的可视化网络，发现在黄芪所有生物活性成分中，槲皮素发挥主要作用；在所有信号通路中，癌症通路可能起主要作用。本研究进一步通过细胞实验证实，不同浓度黄芪培养液对U251 细胞增殖均有抑制和凋亡作用，且其作用强度呈浓度依赖性。

综上所述，黄芪对U251 细胞增殖具有抑制和凋亡作用，主要基因靶点包括AKT1、RELA、PTGS2、MAPL1、TP53。