新型双组分交联封闭聚合物水凝胶促进大鼠创面愈合的研究

金晶 何屹 邬凌峰 李家晔 沈斌 高金来

创面管理是医疗系统管理的重要组成部分[1]。术后创面感染会导致疼痛、愈合时间延长，甚至引发全身感染[2]。目前迫切需要开发理想敷料，以减少创面疼痛，加快创面愈合速度。在无任何敷料的情况下，一旦结痂覆盖创面会降低上皮化速度；但如果使用湿敷料就不易形成结痂，有利于创面快速愈合[3-4]。传统的纱布敷料不能保持创面湿润，纤维组织易与肉芽组织融合，导致更换敷料时疼痛感明显，并可能造成新的组织损伤[5-7]。目前开发了一种新型双组分交联聚合物封闭水凝胶，先在需要封闭的创面覆盖一层植物纤维素衍生物水溶液，再喷涂一层氧化淀粉水溶液，原位快速（3 s）形成不流动的生物水凝胶，将术后创面有效封闭起来，从而减少渗出，促进创面愈合。本研究通过构建大鼠创面模型，就新型双组分交联封闭聚合物水凝胶对大鼠创面愈合的作用作一探讨，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雄性SD 大鼠18 只，购自上海Legen 生物技术有限公司[生产许可证号为SCXK（浙）2019-0002]，体重（200±20）g。大鼠饲养于嘉兴学院实验动物房[使用许可证号为SYXK（浙）2020-0007]，室温20～25 ℃，湿度40%～70%，不限制饮水、进食。本研究经嘉兴学院医学院实验动物伦理委员会审查通过（批准文号：JUMC2022-171）。

1.2 试剂和仪器 新型双组分交联聚合物封闭水凝胶（批号：20200618）购自易敏（浙江）生物医药科技有限公司，硫酸庆大霉素（批号：N23030761）购自辰欣药业股份有限公司，水合氯醛（批号：20220320）购自青岛宇龙海藻有限公司，HE 染色试剂盒（批号：G1120）购自北京索莱宝科技有限公司，qRT-PCR 试剂盒（批号：A46012）购自美国Thermo Fisher 有限公司。qRTPCR 仪（型号：Stepone plus 7500）购自美国ABI 公司，荧光显微镜（型号：BX53）购自日本OLYMPUS 公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠创面模型构建 按0.3 mL/100 g剂量取10%水合氯醛麻醉大鼠，剃除大鼠背部毛皮并消毒皮肤，用打孔器在背部皮肤打孔（直径8 mm，深度2 mm）。

1.3.2 大鼠分组与处理 按随机数字表法将建模后的SD 大鼠分为水凝胶组、硫酸庆大霉素组、对照组，每组6 只。其中水凝胶组每天在创面处涂抹植物纤维素衍生物水溶液25 μL，同时喷涂氧化淀粉水溶液25 μL，1 次/d；硫酸庆大霉素组每天在创面处涂抹硫酸庆大霉素50 μL 作为阳性对照，1 次/d；对照组不作任何处理。药物干预第10 天10%水合氯醛麻醉大鼠，以大鼠的背部创面中心为原点，取直径10 mm、深度达真皮层的创面组织进行后续实验，包括对创面组织进行HE染色并观察组织形态，以及采用qRT-PCR 法检测创面组织中IL-6、TNF-α、转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）水平。实验结束后，采用CO2窒息法对所有大鼠进行无痛安乐死处理。

1.3.3 大鼠创面面积测量 每天记录创面愈合情况，采用相机取固定高度和角度并以直尺作为对照标准，对创面进行拍照保存，使用Image Pro Plus 软件计算创面面积。

1.3.4 大鼠创面组织病理学检查及肉芽组织面积测量 采用HE 染色。取药物干预10 d 后的创面组织于4%多聚甲醛溶液中进行固定，石蜡包埋，切片（厚度5 μm）。取肉芽组织面积最大的切片，按照HE 染色试剂盒说明书进行染色，在光镜下观察并拍照，使用图像分析软件测量创面肉芽组织面积。

1.3.5 大鼠创面组织中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 相对表达量检测 采用qRT-PCR 法。取药物干预10 d后的创面组织30 mg，加入1 mL Trizol 后使用组织研磨器在冰浴中将组织样本研磨成匀浆，加入适量氯仿离心后吸取RNA 层。将其转移至另一个EP 管中，加入等体积的异丙醇并混匀，4℃下12 000 r/min离心10 min后RNA 沉于管底。使用1 mL 75%乙醇洗涤后，使用DEPC 水重悬，取1 μg RNA 逆转录成cDNA，反应体系为SYBR Green Mix 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 1 μL，并用Nuclease-Free 补足体积至20 μL，引物序列见表1。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参，采用2-ΔΔCt法计算组织中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 相对表达量。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.4 统计学处理 采用GraphPad Prism 7.0 统计软件。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组大鼠创面面积变化比较 从药物干预第4 天起，水凝胶组和硫酸庆大霉素组大鼠创面面积均明显小于对照组（均P＜0.05），而水凝胶组与硫酸庆大霉素组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图1（插页）。

图1 3 组大鼠创面面积变化比较（A：创面愈合情况，×2；B：创面面积变化，与对照组比较，aP＜0.05）

2.2 3 组大鼠创面肉芽组织面积比较 水凝胶组药物干预10 d 后创面明显愈合，肉芽组织区域较少，真皮组织区域较多，见图2A（插页）。水凝胶组、硫酸庆大霉素组创面肉芽组织面积均明显小于对照组（均P＜0.05），而水凝胶组与硫酸庆大霉素组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图2B（插页）。

图2 3 组大鼠创面肉芽组织面积比较（A：HE 染色结果，×4；B：肉芽组织面积比较，与对照组比较，aP＜0.05）

2.3 3 组大鼠创面组织中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA相对表达量比较 水凝胶组、硫酸庆大霉素组创面组织中IL-6、TNF-α mRNA 相对表达量均明显低于对照组（均P＜0.05），TGF-β mRNA 相对表达量明显高于对照组（P＜0.05）；而水凝胶组与硫酸庆大霉素组创面组织中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 相对表达量比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图3。

图3 3 组大鼠创面组织中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 相对表达量比较（A：IL-6；B：TNF-α；C：TGF-β）

3 讨论

皮肤是人体与外部环境之间最重要的屏障，也是先天免疫系统的重要组成部分。它通过减少微生物的黏附和侵袭[8]，在防止微生物的渗透和预防感染方面起着重要作用。然而，当这个屏障被打破时，机体易被微生物感染。创面愈合是一个复杂的过程，主要经历凝血期、炎症期、增殖期和重建期等4个阶段[9-11]。在凝血期，血小板聚集起到止血的作用；在炎症期，各种生长因子和生物活性物质启动组织修复；在增殖期，纤维细胞增殖并迁移到创面，与内皮细胞一同生长并形成血管；在重建期，角质形成细胞通过合成细胞外基质并参与细胞间信号调控，从而促进基底膜形成。然而，任何一个时期都可能影响创面迁延不愈。本研究通过构建大鼠创面模型，就新型双组分交联封闭聚合物水凝胶对大鼠创面愈合的作用作一探讨，为其临床应用提供理论依据。

新型双组分交联封闭聚合物水凝胶是一种新型液体敷料，生物水凝胶原位快速形成并发挥保护作用，具体机制为带有大量氨基的梳状高分子植物纤维素衍生物与带有大量醛基的星状高分子氧化淀粉通过席夫碱反应交联形成水凝胶，以星状高分子、梳状高分子为基的生物水凝胶能加速成胶反应；而喷涂在底层的植物纤维素衍生物与黏膜具有较强的静电吸引作用，该作用力来自于植物纤维素衍生物分子与水分子、组织上含氢基团（如氨基、羧基等）强的氢键作用以及植物纤维素衍生物高分子上大量羧基和氨基与黏膜组织表层细胞、蛋白、细胞间骨架上带正电性基团、负电性基团之间的静电吸引作用，上述这些作用赋予水凝胶稳固黏着创面的能力，从而达到封闭创面的效果，进而减少渗出，抑制创面组织炎症因子（IL-6、TNF-α）的分泌，增加TGF-β 因子分泌，诱导纤维细胞增殖，最终促进创面愈合。本研究结果显示，与对照组比较，水凝胶组和硫酸庆大霉素组从药物干预第4 天起创面面积和肉芽组织面积均明显缩小，创面组织中IL-6、TNF-α mRNA 相对表达量均明显降低，TGF-β mRNA 相对表达量均明显升高，差异均有统计学意义；而水凝胶组与硫酸庆大霉素组创面肉芽组织面积以及组织中IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA 相对表达量比较，差异均无统计学意义；以上结果提示水凝胶与庆大霉素在促进创面愈合方面显示出相似的疗效。随着抗生素耐药性问题的日益突出，非抗生素创面治疗方案，如水凝胶的出现为患者提供了更多选择，有助于减少抗生素耐药的风险。而水凝胶作为新型创面治疗材料，具有独特的纤维网状结构，具有封闭创面、减少渗出的同时又能保持透气、防水的特点，为创面愈合提供良好的修复环境。此外，水凝胶在烧伤和慢性创面治疗中的应用价值也值得进一步探究。未来研究方向也可关注改进水凝胶的配方，以提高其治疗效果，并在更广泛的创面类型上进行有效性测试。

综上所述，新型双组分交联封闭聚合物水凝可加速大鼠创面愈合，减少炎症反应。