麦冬多糖对破骨细胞分化的影响研究

易 倩,张合富,李官翔,樊丽莎,邓加加,张伶燕,张 健

(1.贵州中医药大学药学院,贵州 贵阳 520025;2.贵州中医药大学实验动物研究所,贵州 贵阳 520025)

骨骼作为维持机体运动的重要器官,在体内发挥着运动、支持、保护、造血、贮存矿物质等功能。正常情况下,机体内成骨细胞介导的骨形成能与破骨细胞介导的骨吸收保持动态平衡,维持骨骼的正常功能[1]。中老年人,尤其是绝经后的妇女,其破骨细胞过度激活、骨吸收增加,使得骨量降低、骨骼脆性增加,在微观结构上呈现疏松多孔状态,即骨质疏松症。因此,抑制破骨细胞分化成为防治骨量丢失、治疗骨质疏松症的重要靶点。麦冬是我国使用广泛的传统中药。据张锡纯《医学衷中参西录》中记载,麦冬具有养阴润肺、益胃生津、清心除烦等功效。麦冬多糖(OPS)是麦冬的主要成分,在麦冬中的提取率高达35%,这可能与麦冬的功效有关[2]。近期研究发现,OPS的作用更加广泛,具有抗炎、抗氧化、抗衰老、降血糖、保护心肌、提高机体免疫力等多种功效[2-7]。研究发现,OPS通过降低氧化应激对巨噬细胞的损伤,减少细胞凋亡,从而起到保护巨噬细胞的作用[8],但其在骨代谢领域的功能尚未揭示。破骨细胞起源于骨髓单核巨噬细胞(BMMs),是体内唯一具有骨吸收能力的终末分化细胞。本研究探讨了OPS对核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导的BMMs破骨分化、骨吸收的影响及潜在机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 6～8周SPF级C57BL/6j雌性小鼠10只,体重18～22 g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[SCXK(湘)2022-0011],饲养于贵州中医药大学实验动物研究所动物房[SYXK(黔)2021-0005],温度20～25 ℃,湿度40%～60%,自由采食及饮水,相关饲养及实验操作经贵州中医药大学实验动物伦理委员会批准(20220131)。麦冬购于张家港市绿色中药饮片有限公司(批号：190115)。

1.2主要试剂与仪器 α-MEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司),M-CSF、RANKL(美国Peprotech公司)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒(美国Sigma公司),TRAP活性检测试剂盒、细胞活性试剂盒、青-链霉素双抗、RNAeasyTM动物RNA抽提试剂盒、BeyoRTTMⅢ cDNA合成试剂盒、BeyoFastTMSYBR Green定量聚合酶链式反应(PCR)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。多功能酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司),相差显微镜(日本Olympus公司),T100TMPCP仪(美国Bio-Rad公司),实时荧光定量PCR仪(杭州博日科技有限公司),NanoDrop微量分光光度计(美国Thermo Fisher公司)。

1.3方法

1.3.1OPS提取 参照张靖等[9]介绍的方法对麦冬中的OPS进行提取,主要步骤为：取麦冬1 000 g加95%乙醇浸泡后,经水浴回流提取2次,随后药渣加9倍量水煎煮3次,所有药液合并浓缩至1 L,进一步经醇沉、乙醚、丙酮洗涤后,60 ℃下干燥OPS粗粉末。随后采用三氯乙酸法去除蛋白质,以苯酚-硫酸法测定OPS水平。根据OPS测定结果(实测值：88.76%)将其制备成含糖量为1 mg/mL的母液,经高压灭菌后,于4 ℃保存备用。

1.3.2小鼠BMMs分离和培养 小鼠BMMs分离和培养步骤：(1)小鼠麻醉后脱颈处死,浸泡于75%乙醇中,置于超净工作台上;(2)迅速解剖小鼠并分离出双侧股骨,剔除附着物,用含双抗的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次后,剪除股骨近、远端,暴露骨髓腔;(3)使用1 mL注射器抽取PBS反复冲洗骨髓腔,吹出骨髓组织,重悬于α-MEM完全培养基,1 200 r/min离心8 min后,弃上清液;(4)使用含50 ng/mL M-CSF完全培养基重悬后,接种于100 mm细胞培养皿中,过夜;(5)弃培养基,用无菌PBS冲洗3次后,加10 mL含50 ng/mL M-CSF完全培养基,隔天换液;(6)重复步骤(5)操作直至细胞呈短梭形,密度达80%～90%;(7)培养好的细胞使用PBS冲洗3次,用移液枪吹落后混匀备用,即为BMMs。后续BMMs培养时使用含50 ng/mL M-CSF完全培养基,进行破骨分化诱导时采用含 0 ng/mL RANKL、50 ng/mL M-CSF完全培养基。

1.3.3BMMs细胞活性检测 按每孔3×103个细胞的密度将BMMs接种于96孔板中,按实验设计分为对照组和3个不同水平OPS处理组。对照组使用含50 ng/mL M-CSF完全培养基(即0 μg/mL OPS),OPS处理组在此基础上加入2.5、10.0、或40.0 μg/mL OPS(A、B、C组)。在给药后48、96 h,每孔加入10 μL CCK-8试剂,继续培养2 h后,使用酶标仪在450 nm波长处测定每孔吸光度(OD)值,计算细胞活性。

1.3.4BMMs破骨分化诱导 将BMMs按每皿1×105个细胞的密度接种到35 mm培养皿中,过夜后,使用破骨诱导分化完全培养基(α-MEM+10%胎牛血清+1%双抗+1%谷氨酰胺+50 ng/mL RANKL+50 ng/mL M-CSF)进行破骨分化诱导,隔天换液。5 d后,在显微镜下可见BMMs开始汇聚、融合,出现多核细胞,7 d可见边界清晰、巨大的成熟破骨细胞。

1.3.5破骨细胞TRAP活性检测 为研究OPS对TRAP活性的影响,将BMMs按每皿1×105个细胞的密度接种到35 mm培养皿中,过夜、贴壁。随后,按实验设计更换为含不同水平OPS(0、2.5、10.0、40.0 μg/mL)的诱导培养基,隔天换液,7 d后诱导为成熟的破骨细胞。收集各培养孔细胞,并按照TRAP活性检测试剂盒说明书测定破骨细胞TRAP活性及蛋白水平。

1.3.6破骨细胞形成检测 将BMMs诱导为成熟的破骨细胞后,弃培养基,用PBS润洗2次,每孔加500 μL 4%多聚甲醛,固定10 min。弃甲醛、用PBS冲洗2遍后,按照试剂盒说明书介绍方法进行TRAP染色。使用倒置显微镜拍摄染色图,TRAP阳性且细胞核数目大于或等于3个的细胞计为破骨细胞,并通过ImageJ软件进行破骨细胞相对大小的计算,破骨细胞相对大小=各组破骨细胞大小/对照组中破骨细胞大小的平均值。

1.3.7破骨细胞骨吸收能力检测 将BMMs按每孔3×103个细胞的密度接种到骨培养板中,诱导为成熟破骨细胞后,弃培养基,用0.1%次氯酸钠溶液漂白骨培养板。生物显微镜下观察骨陷窝形成情况,获取骨吸收图像,并用Image Pro6.0软件分析图像。

1.3.8采用逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法测定破骨细胞分化标志基因mRNA表达 将BMMs按每孔1×104个细胞的密度接种于6孔板中,过夜、贴壁后,按1.3.3分组培养细胞。7 d后弃培养基,用预冷的PBS冲洗1次后,每孔加入300 μL总RNA提取试剂,按照RNAeasyTM动物RNA抽提试剂盒说明书的方法提取细胞总RNA后,用NanoDrop微量分光光度计测定总RNA水平。随后,按BeyoRTTMⅢ cDNA合成试剂盒说明书中介绍的方法逆转录合成cDNA,检测碳酸酐酶2(Car2)、组织蛋白酶K(CTSK)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、TRAP、液泡型H+-ATP酶(V-ATPase) mRNA表达水平。RT-qPCR所用引物序列见表1。

表1 破骨细胞分化标志基因的引物序列

2 结 果

2.1不同水平OPS对BMMs细胞活性的影响 A、B、C组48、96 h时OD值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 不同水平OPS对BMMs细胞活性的影响

2.2不同水平OPS对破骨细胞分化的影响 细胞培养7 d后,经固定、TRAP染色,在倒置显微镜下观察可见,对照组中出现大量多核、肥大、煎饼样的成熟破骨细胞。与未添加OPS的对照组相比,添加OPS会显著抑制破骨细胞生成。B组成熟破骨细胞数目显著下降,C组只有极少量破骨细胞生成。见图2。与对照组(1.00±0.15)比较,B组成熟破骨细胞数目降低至(0.61±0.06)(P<0.05),而C组成熟破骨细胞数目为(0.31±0.03)(P<0.05)。见图3。

图2 倒置显微镜下观察各组破骨细胞分化情况(TRAP染色,100×)

图3 不同水平OPS对破骨细胞分化的影响

2.3不同水平OPS对破骨细胞TRAP活性的影响 与对照组相比,B、C组5 d时破骨细胞TRAP活性显著降低(P<0.05)。A、B、C组7 d时破骨细胞TRAP活性显著低于对照组(P<0.05)。见图4。

图4 不同水平OPS对破骨细胞TRAP活性的影响

2.4不同水平OPS对破骨细胞骨吸收能力的影响 对照组中出现大量骨吸收陷窝,A组骨吸收陷窝明显减少,C组仅可见少量骨吸收陷窝。见图5。以对照组骨吸收面积为1,进一步统计分析显示,A、B、C组骨吸收面积仅为对照组的71%、40%和6%(P<0.05)。见图6。

图5 骨吸收图(100×)

图6 不同水平OPS对破骨细胞骨吸收能力的影响

2.5不同水平OPS对破骨细胞相关基因mRNA表达水平的影响 与对照组比较,B、C组Car2、CTSK、MMP-9、TRAP、V-ATPase mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。见图7。

图7 不同水平OPS对Car2、CTSK、MMP-9、TRAP、V-ATPase mRNA表达水平的影响

3 讨 论

麦冬是一种广泛使用的传统中草药,OPS作为麦冬的主要成分,具有抗炎、抗氧化、降血糖、保护心肌、提高机体免疫力等功效。王晓颖[10]研究发现,麦冬糖浆能显著降低放射性肺炎模型小鼠血浆中白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子β1、肺组织的脯氨酸、超氧化物歧化酶、MMP-2及其组织抑制物蛋白水平。OPS还能够调节单胺氧化酶B、IL-2、TNF-α、IL-6、γ干扰素及IL-10 mRNA表达,增强机体免疫力[11]。最近研究发现,OPS还具有抗肿瘤作用,羧甲基化修饰的OPS能有效地抑制癌细胞增殖[12]。且给S-180荷瘤小鼠灌胃2.0 g/kg OPS,可显著提高巨噬细胞吞噬能力及血清IL-1β、TNF-α水平[13]。然而,OPS对骨吸收的影响鲜有报道。

破骨细胞来源于单核巨噬细胞系统[14]。破骨细胞的过度激活及伴随骨吸收功能的过度活化是造成机体骨质疏松的重要原因。破骨细胞的活性主要体现在能否从单核巨噬细胞分化为破骨细胞,以及其溶骨功能的强弱。本研究结果显示,40.0 μg/mL及以下水平的OPS对BMMs增殖无明显抑制作用。对RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞进行TRAP染色及骨吸收能力检测,结果显示,添加OPS能显著抑制破骨细胞形成,减少骨吸收,且40.0 μg/mL OPS处理的BMMs几乎不能形成成熟的破骨细胞。因此,OPS是一种潜在的有效抗骨吸收药物。OPS对破骨细胞的显著抑制作用可能与其抗氧化和抗炎功能相关。最近研究发现,OPS可有效地清除氧自由基,降低HIH/3T3细胞损伤诱导的单线态氧的产生及炎症因子表达量[15]。另一方面,麦冬水提物能显著抑制LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7中一氧化氮的分泌和TNF-α蛋白表达,从而发挥抗炎作用[16]。在破骨细胞分化过程中,氧自由基的升高能激活机体的破骨细胞,促进骨吸收[17-19]。多种炎症因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-11等可显著促进破骨细胞的分化[20]。既然OPS具有有效的抗氧化及抗炎作用,而且活性氧及炎症因子在破骨细胞分化过程中发挥重要作用,那么OPS对破骨细胞分化功能的抑制也与其抗氧化及抗炎作用相关,具体的机制有待进一步研究。

CTSK作为半胱氨酸蛋白酶家族中的一员,在破骨细胞中溶酶体和细胞质囊泡中大量表达[21],其参与有机骨基质蛋白中Ⅰ型胶原、骨桥接素和骨粘连蛋白的降解,是发挥骨吸收功能的一个关键酶[22]。人CTSK突变会导致致密性成骨不全,小鼠CTSK基因敲除会出现骨基质降解障碍[23]。ATPase属于质子泵的一种,位于破骨细胞膜的褶皱缘处,用于维持破骨细胞封闭区的酸性环境。ATPase基因敲除小鼠的破骨细胞成熟度降低、骨吸收功能受到影响,骨骼硬度增加[24]。Car2主要存在于破骨细胞中的胞浆中,能催化二氧化碳的水合作用,产生质子[21]。TRAP位于破骨细胞的微粒体中,通过褶皱缘分泌进入封闭区,与其他酶一起参与骨基质中矿化物的降解,是骨吸收和破骨细胞活性的良好标志物,但其确切的生理作用还不清楚[25]。MMP-9属于基质金属蛋白酶家族中的一员。作为一种胞外蛋白酶,MMP-9在破骨细胞中高度表达,参与细胞外基质的降解,最终通过影响破骨细胞的迁移而影响破骨细胞活性[26-27]。MMP-9能特异性溶解非矿化软骨,促进破骨细胞活化;MMP-9缺乏会延缓破骨细胞募集,抑制骨吸收,同时MMP-9还可以抑制成骨过程中细胞迁移[28]。因此,可通过检测破骨细胞分化过程中上述基因表达的变化,探索OPS影响破骨细胞分化的机制。

本研究中,OPS可浓度依赖性地抑制M-CSF和RANKL刺激下参与胶原蛋白降解和骨陷窝形成的CTSK和MMP-9 mRNA表达,提示OPS对破骨细胞的骨吸收功能具有明显的抑制作用。破骨细胞中,Car2催化产生的质子经V-ATPase转运至破骨细胞褶皱缘,并维持吸收陷窝的酸性环境。本研究结果显示,添加OPS可以抑制破骨细胞中Car2和V-ATPase mRNA表达,提示OPS可能会升高骨陷窝pH值,抑制骨吸收酶活性,降低骨吸收。

综上所述,OPS可显著抑制破骨细胞分化功能,抑制骨吸收,但其深层机制仍不清楚,有待进一步研究。