九肽-1/依克多因经皮共递送纳米脂质体美白修复功效研究

王 曦,陈 丹,罗 丹,陈 璇,马佳月升,张亮韬,刘 卫2,Δ

[1.武汉百思凯瑞生物科技有限公司,湖北 武汉 430075;2.华中科技大学国家纳米药物工程技术研究中心,湖北 武汉 430075;3.华中科技大学生命科学与技术学院,湖北 武汉 430074;4.样美生物科技(北京)有限公司,北京 100020]

九肽-1是一种含有9个氨基酸的小分子肽,通过竞争性方式与黑色素皮质素受体1相结合,阻碍酪氨酸酶活化,进而抑制黑色素的生成[1]。依克多因能阻止应激因子损伤细胞,隔离紫外线辐射、变应原、污染物等对皮肤的损害,1.0%依克多因能有效防止皮肤细胞损伤,皮肤自愈修复速度提升了2～3倍[2-3]。利用纳米脂质体包载技术,可以改善皮肤功效活性成分的稳定性,促进活性成分进入靶细胞,有效提高活性成分的生物利用率[4-5]。本研究探讨了九肽-1/依克多因经皮共递送纳米脂质体(Non/Ect-NLPs)的皮肤美白和修复作用,以期为研制具有美白修复功效的护肤品提供理论和技术基础。

1 资料与方法

1.1主要试剂与细胞 九肽-1购自南京莱昂生物科技公司;依克多因购自济南华熙生物科技公司;卵磷脂购自上海太伟药业公司;聚乙二醇-40(PEG-40)氢化蓖麻油购自德国巴斯夫公司;1,3-丙二醇、1,2-己二醇、甘油购自国药集团公司。DMEM高糖培养基、胎牛血清、青链霉素、胰蛋白酶-EDTA购自美国Gbico公司;L-多巴、酪氨酸、TritonX-100、3% H2O2、α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)购自美国Sigma-Aldrich公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)、活性氧检测试剂盒购自上海碧云天生物技术公司;人源水通道蛋白-3(AQP3)、丝聚合蛋白(FLG)、紧密连接蛋白1(Claudin-1)的酶联免疫吸附试验试剂盒购自江苏酶免生物科技公司。人角质形成细胞(HaCaT)、小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)购自中国科学院昆明细胞库。

1.3方法

1.3.1Non/Ect-NLPs的制备及粒径等测定 称取处方量卵磷脂、胆固醇、PEG-40氢化蓖麻油和1,3-丙二醇为A相,另称取处方量九肽-1、依克多因、1,2-己二醇和甘油等溶于适量超纯水中为B相,于40 ℃水浴混匀,将A相和B相混合,继续搅拌,高压均质机均质溶液3次后,得到Non/Ect-NLPs。取适量Non/Ect-NLPs,稀释适当倍数,测定粒径、多分散性指数(PDI)和Zeta电位。

1.3.2观察细胞摄取行为 采用异硫氰酸荧光黄(FITC)代替活性成分制备FITC标记的纳米脂质体(FITC-NLPs),与游离FITC中荧光标记水平相同。将B16F10细胞以3×105/mL的密度接种于共聚焦皿,每皿2 mL,培养24 h,弃上清液,加入含游离FITC、FITC-NLPs(FITC均为1 μg/mL)的培养基,置于细胞培养箱摄取4 h,弃去培养基,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次,采用组织固定液固定细胞,在避光环境下,依次用罗丹明B(RhoB)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液(均为1 μg/mL)染色各15 min,采用激光共聚焦显微镜观察拍照。

1.3.3细胞安全性评价 将1.5×105/mL的HaCaT细胞加入96孔板,每孔100 μL,培养24 h,每孔分别加入100 μL含有62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/mL Non/Ect-NLPs(Non/Ect-NLPs组)及游离成分溶液(游离成分溶液组,与Non/Ect-NLPs组中活性成分水平相同)的DMEM完全培养基,对照组仅加100 μL DMEM完全培养基。每组3个平行孔,重复3次。继续培养24 h,于450 nm波长处测吸光度,计算细胞存活率。

1.3.4酪氨酸酶活性测定 将5.0×104/mL的B16F10细胞加入24孔板,每孔500 μL,培养24 h。对照组仅加入完全培养基,模型组、游离成分溶液组及Non/Ect-NLPs组加入100 nmol/L α-MSH制备黑素高表达细胞模型。Non/Ect-NLPs组同时加入125.0、250.0、500.0 μg/mL Non/Ect-NLPs,游离成分溶液组与Non/Ect-NLPs组中活性成分水平相同,均用DMEM完全培养基配制。每组3个平行孔,重复3次。培养48 h后,弃去上清液,每孔加入1% TritonX-100的PBS 200 μL于-80 ℃冰箱裂解,取细胞裂解液离心,取各孔上清液100 μL,加入0.1% L-多巴100 μL,37 ℃放置1 h,于490 nm波长处测吸光度,计算酪氨酸酶活性[6]。

1.3.5黑色素水平测定 将5.0×104/mL的B16F10细胞加入6孔板,每孔2 mL,培养24 h。各分组及加样方式同“1.2.4”。每组设3个平行孔,重复3次。培养48 h后,PBS清洗细胞后,每孔加入含有10%二甲基亚砜的1.0 mmol/L氢氧化钠溶液300 μL,在90 ℃水浴裂解细胞3 h,于405 nm波长处测各孔吸光度,计算黑色素水平[6]。

1.3.6细胞抗氧化分析 将1.5×105/mL的HaCaT细胞加入96孔板,每孔100 μL,培养24 h。各分组及加样方式同“1.2.4”,仅在造细胞氧化损伤模型时,将100 nmol/L α-MSH替换为0.8 mmol/L H2O2。每组3个平行孔,重复3次。继续培养24 h后,于450 nm波长处测吸光度,计算细胞存活率。

1.3.7细胞迁移分析 将5.0×105/mL的HaCaT细胞加入6孔板,每孔2 mL,培养24 h。用黄色枪头在细胞生长的中央区域划1条线,PBS清洗细胞3次,显微镜拍照观察加样前的划痕宽度。拍照后,对照组加入无血清培养基,其他组分别加入250.0 μg/mL Non/Ect-NLPs与游离成分溶液的无血清培养基。培养24 h后,用显微镜拍照观察加样后的划痕宽度,计算细胞迁移率,实验重复3次[7]。

对电力行业而言，电力生产涉及的运行工况、参数、设备运行状态等实时生产数据，现场总线系统所采集的设备检测数据以及发电量、电压稳定性等方面的数据，电力企业运营和管理数据，共同构成了“电力大数据”。[1]目前，大数据分析技术在变电站生产运维和安全管控中的应用较少。而大数据技术应用到电力生产运维工作中将发挥巨大的作用和产生良好的经济价值。[2]本文将大数据技术与最优运维策略、设备状态趋势预判、现场作业安全管控、顺控操作时远方视频验证等方面进行结合，来阐述对变电站运维模式的改进和提高运维效率的作用。

1.3.8皮肤修复相关因子检测 将1.0×105/mL的HaCaT细胞加入24孔板,每孔500 μL,培养24 h。对照组仅加DMEM完全培养基,其他组分别加入含有125.0、250.0、500.0 μg/mL Non/Ect-NLPs与游离成分溶液的DMEM完全培养基。每组3个复孔,实验重复3次。继续培养48 h,检测上清液中AQP3、FLG、Claudin-1水平。

2 结 果

2.1粒径、PDI和Zeta电位 Non/Ect-NLPs为淡黄色透明液体,测得其粒径为(34.3±0.1)nm,PDI为(0.195±0.007),Zeta电位为(-31.7±0.9)mV。

2.2黑素细胞摄取情况 孵育相同时间,FITC-NLPs细胞质中荧光强度明显强于游离FITC,而游离FITC主要聚集于B16F10细胞表面。FITC-NLPs能够被快速摄取进入B16F10细胞。见图1。

注：Merge是将DAPI、RhoB、FITC图片进行组合。

2.3细胞安全性比较 不同水平Non/Ect-NLPs组和游离成分溶液组中HaCaT细胞活性均在80%以上,无细胞毒性。见图2。

注：与对照组比较,aP<0.01;与同水平游离成分溶液组比较,bP<0.01;A～E组分别为62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/mL Non/Ect-NLPs组与相应游离成分溶液组。

2.4酪氨酸酶活性比较 与游离成分溶液组比较,Non/Ect-NLPs水平为250.0、500.0 μg/mL时,其对B16F10细胞酪氨酸酶活性显著降低(P<0.05)。Non/Ect-NLPs抑制黑素细胞酪氨酸酶的能力强于同剂量游离成分。见图3。

注：与模型组相比,aP<0.01;与同水平游离成分溶液组相比,bP<0.05,cP<0.01。

2.5黑色素水平比较 与游离成分溶液组比较,Non/Ect-NLPs水平为125.0、500.0 μg/mL时,其能显著抑制B16F10细胞分泌黑色素(P<0.05)。Non/Ect-NLPs抑制黑素细胞黑色素分泌能力强于同剂量游离成分。见图4。

注：与模型组相比,aP<0.01;与同水平游离成分溶液组相比,bP<0.05,cP<0.01。

2.6细胞抗氧化能力比较 采用0.8 mmol/L H2O2损伤HaCaT细胞后,其存活率为50.36%,细胞氧化损伤明显。与模型组比较,Non/Ect-NLPs水平为250.0、500.0 μg/mL时,可显著提高氧化损伤细胞的存活率(P<0.05)。与游离成分溶液组比较,Non/Ect-NLPs水平为500.0 μg/mL时,可显著提高氧化损伤细胞的存活率(P<0.01)。Non/Ect-NLPs的细胞抗氧化功效更为显著。见图5。

注：与模型组相比,aP<0.01;与同水平游离成分溶液组相比,bP<0.01。

2.7细胞迁移能力比较 与对照组比较,游离成分溶液组和Non/Ect-NLPs组能显著促进HaCaT细胞迁移(P<0.01)。与游离成分溶液组比较,Non/Ect-NLPs组能显著促进HaCaT细胞迁移(P<0.01)。Non/Ect-NLPs促进HaCaT细胞迁移的能力优于游离成分溶液。见图6、7。

图6 对HaCaT细胞迁移的影响

注：与对照相比,aP<0.01;与游离成分溶液组相比,bP<0.01。

2.8皮肤修复相关因子水平比较 与对照组比较,游离成分溶液组、Non/Ect-NLPs组AQP3、FLG、Claudin-1水平显著增高(P<0.05)。与游离成分溶液组比较,500 μg/mL Non/Ect-NLPs组AQP3、FLG水平显著升高(P<0.05);250.0、500.0 μg/mL Non/Ect-NLPs组Claudin-1水平显著升高(P<0.05)。Non/Ect-NLPs较相同水平游离成分溶液具有更好的皮肤保湿修复功效。见图8。

注：与对照组相比,aP<0.05,bP<0.01;与同浓度游离成分溶液组相比,cP<0.05,dP<0.01。

3 讨 论

目前,功效性化妆品产品大多存在功效成分单一、透皮吸收困难等问题。纳米脂质体作为一种新型给药递送系统,制剂质量稳定,且所载活性成分经包裹后能有效提高成分稳定性。纳米脂质体粒径小,能增强药物活性成分的经皮扩散速率及药物的经皮吸收[8]。共输送纳米载体可同时负载多种美白作用机制的功效成分,实现多靶点多效护肤功效成分协同增效[6]。采用经皮给药纳米载体技术,将九肽-1和依克多因共包载于同一纳米脂质体中,解决活性成分极性强、难透皮吸收、难缓释等问题,可实现将美白修复活性成分的皮肤靶向共输送,达到协同增效及缓释作用[8-9]。在本团队已完成的工作基础上[7,10],本研究对Non/Ect-NLPs的皮肤美白和修复作用进行了探索。

本文构建的Non/Ect-NLPs平均粒径为(34.3±0.1)nm,PDI为(0.195±0.007),Zeta电位为(-31.7±0.9)mV。Non/Ect-NLPs能促进B16F10细胞对活性成分的摄取,抑制B16F10细胞的酪氨酸酶活性和黑色素水平,缓解皮肤细胞氧化损伤,从而直接减少黑色素的产生[11-12]。Non/Ect-NLPs可促进角质形成细胞迁移,提高皮肤修复因子AQP3、FLG、Claudin-1的分泌量,提高皮肤保湿修复功能。

综上所述,Non/Ect-NLPs具有美白皮肤和保湿修复作用,实现了不同机制活性成分的协同增效作用,在美白修复护肤品中有较好应用前景。