松果菊苷对尿毒症大鼠肾损伤的影响及机制 Δ

2024-02-02武汉市中医医院肾病科武汉430014

中国药房 2024年2期

熊玮，彭斌，高智（武汉市中医医院肾病科，武汉 430014）

尿毒症（uremia，URE）是慢性肾脏病的终末阶段，也是急性肾损伤发展的最后状态。急性肾损伤若不及时有效地治疗，随着疾病的进展会出现恶化或延迟，进而发展为慢性肾功能不全、肾功能衰竭，最终发展为URE。

管花肉苁蓉是一种具有肝、肾、肠保护作用的植物，松果菊苷（echinacoside，ECH）是其主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗神经毒素、抗细胞凋亡和保护神经等多种生物学效应[1]。目前ECH 在临床上的应用尚未见报道，但有研究显示ECH 可通过降低URE 大鼠血清中白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 的含量，改善其肾功能[2]；ECH可修复免疫系统动态平衡、抑制炎症反应、保护肾功能，改善脓毒症大鼠急性肾损伤[3]。ECH还能够通过抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路来抑制下游炎症因子的产生，减轻炎症反应[4]。p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）是NF-κB 上游的信号通路，抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路的激活能减轻5/6肾切除大鼠炎症反应和肾损伤[5]。基于此，本文研究了ECH对URE大鼠肾损伤和p38 MAPK/NF-κB信号通路的影响，初步探讨其作用机制，旨在为URE的治疗提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括JIDI-20D 型台式多用途高速离心机（广州吉迪仪器有限公司）、HBS-1096A型酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）、BX53M 型光学显微镜[仪景通光学科技（上海）有限公司]、LSM 900 型共聚焦显微镜（北京普瑞赛司仪器有限公司）、Mini-PROTEAN Tetra Cell 型电泳仪[迪图（上海）生物科技有限公司]、Tanon MINI Space系列多功能凝胶图像分析系统（上海天能生命科学有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

ECH（货号HY-N0020，纯度99.65%）和茴香霉素（p38 MAPK 信号通路激活剂，货号HY-18982，纯度99.44%）均购自美国MCE 公司；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β、IL-6 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（货号分别为J22405、J22380、J22434）均购自武汉吉立德生物科技有限公司；血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、β2-微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、24 h 尿蛋白（24 h urine protein，24 h UP）、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）、肾损伤分子1（kidney injury molecule-1，KIM-1）、胱抑素C（cystatin C，Cys-C）ELISA 试剂盒（货号分别为CB10659-Ra、CB10155-Ra、CB12464-Ra、CB10651-Ra、CB10849-Mu、CB10747-Ra、CB10229-Ra）均购自上海科艾博生物技术有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA试剂盒（货号分别为ml077384、ml059387）均购自上海酶联生物科技有限公司；兔抗p38 MAPK单克隆抗体和兔抗磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）多克隆抗体（货号分别为AF7668、AF5887）均购自上海碧云天生物技术有限公司；小鼠抗E-上皮钙黏素（E-cadherin）单克隆抗体、兔抗α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle protein，α-SMA）单克隆抗体、兔抗NF-κB p65多克隆抗体、兔抗磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）单克隆抗体、兔抗β-actin 多克隆抗体和山羊抗兔IgG 二抗（货号分别为ab231303、ab124964、ab19870、ab76302、ab8227、ab6721）均购自英国Abcam公司。

1.3 动物

SPF级SD大鼠，雄性，体重200～220 g，购自湖北贝恩特生物科技有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（鄂）2021-0027。本研究方案符合实验动物伦理学要求，经武汉华联科生物技术有限公司伦理委员会审核批准，批件号HLK-202304-03。

2 方法

2.1 URE大鼠模型建立

大鼠在适宜的温度和湿度环境下，自由饮食饮水，适应性喂养7 d。根据参考文献方法[6]，利用5/6 肾切除法建立URE 大鼠模型：用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，背部剃毛消毒，左侧背部处切口，暴露肾脏，分离肾组织，解剖肾包膜，切除肾脏上、下极部位约2/3 的左肾，止血复位缝合伤口；1周后，再次打开切口完全切除右肾。以仅切开大鼠左侧背部，暴露肾脏，但不摘除肾脏的大鼠作为假手术组（Sham 组）。术后8 周，检测Sham 组和URE 大鼠血清中BUN 和Scr 水平，如果URE 大鼠血清中BUN、Scr水平为Sham组的2～3倍，则表示URE大鼠模型建立成功。

2.2 分组与给药

将建模成功的URE大鼠分为尿毒症（URE）组、ECH低剂量（ECH-L）组、ECH 中剂量（ECH-M）组、ECH 高剂量（ECH-H）组和ECH 高剂量+茴香霉素（ECH-H+Ani）组，每组12 只。ECH-L、ECH-M、ECH-H 组大鼠分别灌胃10、20、40 mg/（kg·d）ECH[2]；ECH-H+Ani 组大鼠灌胃40 mg/（kg·d）ECH，尾静脉注射2 mg/（kg·d）茴香霉素[7]；Sham 组和URE 组大鼠灌胃等体积生理盐水，每天1次，连续给药8周。

2.3 炎症、肾功能及肾损伤相关指标检测

各组大鼠末次给药2 h 后，麻醉，眼眶静脉采血，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、BUN、β2-MG、Scr、NGAL、KIM-1 和Cys-C 水平。使用代谢笼收集各组大鼠24 h的尿液标本，离心，取上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，检测其中24 h UP水平。

2.4 脂质过氧化和抗氧化活性指标检测

眼眶静脉采血后，各组随机取6只大鼠断头处死，分离左肾组织，取部分肾组织进行匀浆，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，检测肾组织中MDA 水平和SOD活性。

2.5 肾组织病理学观察

将各组剩余的6 只大鼠断头处死，分离肾组织，用4%多聚甲醛固定，将组织包埋于石蜡中，切片，干燥，脱蜡并用乙醇水合，苏木精-伊红（HE）染色5 min，使用光学显微镜观察大鼠的肾组织病理学变化。根据肾小管坏死、细胞肿胀、空泡化和肾小管上皮细胞脱落的病变部位面积占比，采用半定量组织学评分法进行评分：0分，＜10%；1分，10%～25%；2分，＞25%～50%；3分，＞50%～75%；4分，＞75%～100%[8]。

2.6 肾组织中α-SMA、E-cadherin阳性表达检测

取“2.5”项下肾组织切片，脱蜡、脱水，分别加入α-SMA和E-cadherin抗体（稀释比例均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；再加入相应二抗，室温孵育；用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）复染细胞核，使用共聚焦显微镜观察α-SMA、E-cadherin阳性表达情况，并计算阳性表达率：阳性表达率＝阳性细胞数/全部细胞数×100%。

2.7 肾组织中p38 MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达检测

取各组大鼠肾组织，提取总蛋白，检测蛋白浓度，电泳、分离后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，并用5%脱脂奶粉封闭1 h；加入p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65、β-actin抗体（稀释比例分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶500、1∶500、1∶1 000），4 ℃孵育过夜；加入山羊抗兔IgG 二抗（稀释比例为1∶5 000），室温孵育1 h；ECL显影，使用Image J 软件分析，以目标蛋白与内参蛋白（β-actin）灰度值比值表示蛋白表达水平，再以p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值表示p38 MAPK、NF-κB p65的磷酸化水平。

2.8 统计学分析

采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计学分析，符合正态分布的资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；不符合正态分布时，组间比较采用Mann-whitneyU秩和检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 ECH对URE大鼠血清中炎症因子水平的影响

与Sham 组相比，URE 组大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6 水平均显著升高（P＜0.05）；与URE 组相比，ECH-L、ECH-M、ECH-H 组大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平均呈剂量依赖性降低（P＜0.05）；与ECH-H 组相比，ECH-H+Ani组大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著升高（P＜0.05）。结果见表1。

表1 ECH 对URE 大鼠血清中炎症因子水平的影响（±s，n＝12，pg/mL）

a：与Sham组相比，P＜0.05；b：与URE组相比，P＜0.05；c：与ECHL组相比，P＜0.05；d：与ECH-M组相比，P＜0.05；e：与ECH-H组相比，P＜0.05。

IL-6 32.61±1.05 58.42±3.47a 51.66±2.55b 46.32±2.12bc 37.86±1.74bcd 42.15±1.87e 205.987＜0.001组别Sham组URE组ECH-L组ECH-M组ECH-H组ECH-H+Ani组FP TNF-α 14.85±1.32 42.62±4.06a 36.04±2.17b 27.42±1.86bc 19.23±2.01bcd 24.01±1.31e 242.772＜0.001 IL-1β 66.43±5.13 161.20±13.86a 134.57±11.23b 108.69±9.11bc 75.92±5.28bcd 89.41±4.92e 198.635＜0.001

3.2 ECH 对URE 大鼠肾功能及肾损伤相关指标的影响

与Sham 组相比，URE 组大鼠的BUN、Scr、β2-MG、24 h UP、NGAL、KIM-1 和Cys-C 水平均显著升高（P＜0.05）；与URE 组相比，ECH-L、ECH-M、ECH-H 组大鼠的BUN、Scr、β2-MG、24 h UP、NGAL、KIM-1 和Cys-C水平均呈剂量依赖性降低（P＜0.05）；与ECH-H组相比，ECH-H+Ani 组大鼠的BUN、Scr、β2-MG、24 h UP、NGAL、KIM-1 和Cys-C 水平均显著升高（P＜0.05）。结果见表2。

表2 ECH对URE大鼠肾功能指标的影响（±s，n＝12）

a：与Sham组相比，P＜0.05；b：与URE组相比，P＜0.05；c：与ECH-L组相比，P＜0.05；d：与ECH-M组相比，P＜0.05；e：与ECH-H组相比，P＜0.05。

组别Sham组URE组ECH-L组ECH-M组ECH-H组ECH-H+Ani组肾功能指标肾损伤指标KIM-1/（ng/L）24.36±2.04 84.51±6.97a 71.62±6.01b 58.19±4.32bc 36.88±2.12bcd 45.17±3.45e 291.283＜0.001 Scr/（μmol/L）41.24±2.13 82.03±7.62a 65.51±4.32b 54.06±3.27bc 46.17±2.09bcd 51.78±2.94e 150.935＜0.001 β2-MG/（ng/mL）12.54±1.03 26.48±1.94a 23.12±1.83b 19.53±1.47bc 14.17±1.28bcd 17.62±1.30e 147.683＜0.001 24 h UP/mg 30.18±2.66 62.01±6.07a 56.32±3.89b 49.58±4.01bc 38.63±2.74bcd 45.88±2.15e 111.055＜0.001 FP Cys-C/（mg/L）0.36±0.01 1.17±0.21a 0.94±0.08b 0.75±0.06bc 0.41±0.03bcd 0.55±0.02e 130.543＜0.001 BUN/（mmol/L）16.34±1.88 38.72±2.76a 34.25±2.34b 28.94±2.02bc 20.38±1.37bcd 25.42±1.82e 196.250＜0.001 NGAL/（ng/mL）3.18±0.12 8.25±1.03a 7.13±0.69b 5.87±0.35bc 3.65±0.20bcd 4.43±0.17e 167.450＜0.001

3.3 ECH 对URE 大鼠脂质过氧化和抗氧化活性指标的影响

与Sham 组相比，URE 组大鼠的MDA 水平显著升高，SOD活性显著降低（P＜0.05）；与URE组相比，ECH-L、ECH-M、ECH-H组大鼠的MDA水平均呈剂量依赖性降低，SOD活性均呈剂量依赖性升高（P＜0.05）；与ECH-H组相比，ECH-H+Ani 组MDA 水平显著升高，SOD 活性显著降低（P＜0.05）。结果见表3。

表3 ECH 对URE 大鼠脂质过氧化和抗氧化活性指标的影响（±s，n＝6）

a：与Sham组相比，P＜0.05；b：与URE组相比，P＜0.05；c：与ECHL组相比，P＜0.05；d：与ECH-M组相比，P＜0.05；e：与ECH-H组相比，P＜0.05。

SOD/（U/mg）405.08±11.53 262.54±4.32a 293.17±11.06b 332.85±8.17bc 376.24±9.54bcd 341.10±5.09e 214.835＜0.001组别Sham组URE组ECH-L组ECH-M组ECH-H组ECH-H+Ani组FP MDA/（nmol/mg）3.67±0.18 9.34±0.87a 7.65±0.52b 6.49±0.47bc 4.03±0.20bcd 5.34±0.23e 124.859＜0.001

3.4 ECH 对URE 大鼠肾组织病理学变化及肾损伤评分的影响

与Sham组相比，URE组大鼠肾组织结构严重破坏，肾小球肿胀严重，基质增多，系膜增厚，肾小管上皮细胞出现大量损伤坏死，并伴有严重的间质炎症，肾损伤评分显著升高[（3.21±0.55）分vs. Sham组（0.00±0.00）分，P＜0.05]；与URE 组相比，ECH-L、ECH-M、ECH-H 组大鼠肾小球肿胀及上皮细胞损伤坏死明显减轻，炎症细胞浸润明显减少，肾损伤评分呈剂量依赖性降低[（2.77±0.65）分、（2.35±0.49）分、（1.74±0.46）分vs. URE 组（3.21±0.55）分，P＜0.05]；与ECH-H 组相比，ECH-H+Ani 组大鼠肾小球和肾间质组织学病变加重，肾损伤评分显著升高[（2.13±0.32）分vs. ECH-H 组（1.74±0.46）分，P＜0.05]。结果见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理学变化显微图（HE染色）

3.5 ECH 对URE 大鼠肾组织中α-SMA 和E-cadherin阳性表达的影响

与Sham 组相比，URE 组大鼠肾组织中α-SMA 阳性表达率显著升高，E-cadherin 阳性表达率显著降低（P＜0.05）；与URE 组相比，ECH-L、ECH-M、ECH-H组大鼠肾组织中α-SMA 阳性表达率均呈剂量依赖性降低，E-cadherin 阳性表达率均呈剂量依赖性升高（P＜0.05）；与ECH-H 组相比，ECH-H+Ani 组大鼠肾组织中α-SMA 阳性表达率显著升高，E-cadherin 阳性表达率显著降低（P＜0.05）。结果见图2、图3和表4。

图2 各组大鼠肾组织中α-SMA阳性表达显微图

图3 各组大鼠肾组织中E-cadherin阳性表达显微图

表4 ECH对URE大鼠肾组织中α-SMA和E-cadherin阳性表达率的影响（±s，n＝6，%）

a：与Sham组相比，P＜0.05；b：与URE组相比，P＜0.05；c：与ECHL组相比，P＜0.05；d：与ECH-M组相比，P＜0.05；e：与ECH-H组相比，P＜0.05。

E-cadherin阳性表达率56.76±3.81 16.25±1.94a 24.81±1.85b 35.62±2.74bc 48.33±2.88bcd 41.09±3.01e 172.638＜0.001组别Sham组URE组ECH-L组ECH-M组ECH-H组ECH-H+Ani组FP α-SMA阳性表达率10.35±1.03 66.10±5.17a 54.67±3.89b 43.13±3.13bc 21.47±1.69bcd 27.82±1.12e 282.771＜0.001

3.6 ECH 对URE 大鼠肾组织中p38 MAPK/NF-κB 信号通路相关蛋白表达的影响

与Sham 组相比，URE 组大鼠肾组织中p-p38 MAPK/p38 MAPK 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 均显著升高（P＜0.05）；与URE 组相比，ECH-L、ECH-M、ECH-H组大鼠肾组织中p-p38 MAPK/p38 MAPK 和p-NF-κB p65/NF-κB p65均呈剂量依赖性降低（P＜0.05）；与ECHH 组相比，ECH-H+Ani 组大鼠肾组织中p-p38 MAPK/p38 MAPK 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 均显著升高（P＜0.05）。结果见图4和表5。

图4 各组大鼠肾组织中p38 MAPK/NF-κB 信号通路相关蛋白表达的电泳图

表5 ECH对URE大鼠肾组织中p38 MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响（±s，n＝6）

a：与Sham组相比，P＜0.05；b：与URE组相比，P＜0.05；c：与ECHL组相比，P＜0.05；d：与ECH-M组相比，P＜0.05；e：与ECH-H组相比，P＜0.05。

组别Sham组URE组ECH-L组ECH-M组ECH-H组ECH-H+Ani组FP p-p38 MAPK/p38 MAPK 0.13±0.02 0.58±0.06a 0.47±0.02b 0.32±0.01bc 0.18±0.01bcd 0.25±0.03e 197.258＜0.001 p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.27±0.01 0.91±0.06a 0.73±0.04b 0.58±0.05bc 0.36±0.02bcd 0.44±0.03e 238.259＜0.001

4 讨论

URE是一种与肾功能恶化相关的临床疾病，严重影响患者的生存质量。炎症和氧化应激反应可能是触发5/6 肾切除大鼠肾损伤的关键原因[5]。α-SMA 增加及E-cadherin 减少会促进上皮间质转化，从而导致肾纤维化[9]。本研究结果显示，ECH 干预后，URE 大鼠肾小球和肾间质组织学病变减轻，肾损伤评分及TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA 水平和α-SMA 阳性表达率均显著降低，SOD活性和E-cadherin阳性表达率均显著升高，且呈剂量依赖性。这表明ECH能抑制URE大鼠肾组织炎症和氧化应激反应，避免肾纤维化，改善肾组织病变。

肾功能异常时，肾小球滤过作用降低，尿液中会出现大量的蛋白质，故以UP 水平作为检测肾功能的重要指标之一。BUN 和Scr 常用于评估肾损伤疾病中的肾功能[10]。β2-MG由淋巴细胞产生，是反映肾损伤时肾小球滤过率和近端小管重吸收功能的指标[11]。NGAL、KIM-1 和Cys-C 是检测肾损伤的生物标志物[12]。本研究结果显示，ECH 干预后，URE 大鼠血清中BUN、Scr、β2-MG、24 h UP、NGAL、KIM-1 和Cys-C 水平均显著降低，且呈剂量依赖性。这表明ECH能抑制肾损伤标志物分泌，增强肾功能，改善URE大鼠肾损伤。

有研究表明，URE 患者治疗后NF-κB 水平下降，炎症状态减轻[13]。URE可通过NF-κB信号通路过度激活来诱发心肌损伤，而抑制该信号通路过度激活，能缓解炎症反应，保护心肌细胞，预防URE 心肌病[14]。本研究结果显示，ECH 干预后，URE 大鼠肾组织中p38 MAPK 和NF-κB p65的磷酸化水平均显著下调，且呈剂量依赖性。而在ECH 处理的基础上给予p38 MAPK 激活剂茴香霉素后，与高剂量ECH 组相比，URE 大鼠肾组织中p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化水平均显著升高，血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、BUN、Scr、β2-MG、24 h UP、NGAL、KIM-1、Cys-C和肾组织中MDA水平、α-SMA阳性表达率均显著升高，肾组织中SOD活性和E-cadherin阳性表达率均显著降低，可见茴香霉素逆转了高剂量ECH对URE大鼠肾损伤的改善作用。这表明ECH能抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路的表达和激活，抑制肾脏炎症反应和氧化应激反应，保护肾功能，减轻URE大鼠肾损伤程度。

综上所述，ECH可能通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路的激活来抑制URE 大鼠的炎症反应和氧化应激反应，增强肾功能，改善肾损伤。但其在临床上改善URE症状的具体作用效果还需要进一步研究。