安罗替尼通过调控NF-κB信号通路对脑胶质瘤细胞恶性表型的影响 Δ

柳 新 ，李青山 ，谢云鹏 ，张圣林 ，董 怡 （.承德医学院附属医院肿瘤科，河北 承德 067000；.承德医学院附属医院神经外科，河北 承德 067000）

脑胶质瘤恶性程度高、发展速度快，为临床常见颅内恶性肿瘤，具有高复发率和高病死率的特点。由于脑胶质瘤的位置特殊，早期症状不明显，故大多数患者在确诊时已处于中晚期，错过了最佳手术治疗时机，加之手术后复发率和转移率较高，放化疗毒副作用极大，严重影响了患者的生存质量[1]。可见，探究有效且安全的药物对于脑胶质瘤患者的临床治疗十分必要。

安罗替尼作为一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，对多种生长因子受体激酶具有抑制作用，且能通过抑制相关转移信号通路来发挥抗肿瘤作用[2]。研究指出，肿瘤细胞的迁移、侵袭与上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）关系密切，当EMT 发生后，肿瘤细胞更具侵袭力，可进一步入侵周围组织、血管及淋巴管等，从而发生远处转移[3]。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路是经典的信号转导通路，能参与调控肿瘤细胞迁移、侵袭、EMT、血管生成等过程[4―5]。可见，阻断NF-κB 信号通路可作为改善肿瘤细胞恶性表型的重要途径。基于此，本研究拟探讨安罗替尼调控NF-κB信号通路对人脑胶质瘤细胞T98G 黏附、迁移、侵袭及EMT样进程的影响，旨在为该药治疗脑胶质瘤提供理论依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括MCO18AIC 型CO2培养箱（日本SANYO 公司）、Multiskan FC 型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）、WMS-1033 型倒置荧光显微镜（上海无陌光学仪器有限公司）、FluorChem HD2型凝胶成像系统（美国ProteinSimple公司）等。

1.2 主要药品与试剂

安罗替尼对照品（货号S8726，纯度≥98%）购自美国Selleck Chemicals 公司；5-氟尿嘧啶对照品（阳性对照，货号S17073-5g，纯度≥98%）、NF-κB 通路抑制剂BAY 11-7082 对照品（批号J07HS173399，纯度≥98%）均购自上海源叶生物科技有限公司；NF-κB通路激活剂prostratin 对照品（批号0000112801，纯度≥98%）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；DMEM-H培养基购自北京索莱宝科技有限公司；RIPA 裂解液、CCK-8 试剂盒均购自日本Dojindo公司；重组人纤维连接蛋白（recombinant human fibronectin，rFN）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；鼠源NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（phosphorylated NF-κB p65，p-NF-κB p65）、上皮钙黏着蛋白（E-cadherin）、神经钙黏着蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、纤维连接蛋白（fibronectin，FN）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG 二抗（批号分别为10021394、10021309、20000374、10010628、10017978、10016772、20000374、20000425）均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 细胞

人脑胶质瘤细胞T98G（编号338721）购自商城北纳创联生物科技有限公司。

2 方法

2.1 人脑胶质瘤T98G细胞培养

取T98G 细胞，复苏后接种于DMEM-H 培养基（含10%胎牛血清、1%青-链霉素）中，于37 ℃、5%CO2条件下培养（培养条件下同），当细胞贴壁至80%～90%时进行传代，取第3代对数生长期细胞用于后续实验。

2.2 安罗替尼对T98G细胞恶性表型影响的考察

2.2.1 细胞增殖活力

取对数生长期细胞，以2×105个/mL接种至96孔板中，每孔100 μL。将细胞分为对照组、安罗替尼不同浓度、阳性对照组，每组设置3个复孔。对照组细胞不进行干预；安罗替尼不同浓度组细胞分别用5、10、20 μmol/L的安罗替尼[6]进行干预；阳性对照组细胞用50 mg/L 的5-氟尿嘧啶[7]进行干预；同时，设置不加细胞的调零孔作为空白组。培养24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，孵育2 h后，使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值，并按下式计算细胞增殖活力：细胞增殖活力＝（OD实验组－OD空白组）/（OD对照组－OD空白组）。

2.2.2 细胞黏附能力

将20 μg/mL 的rFN（以不含胎牛血清的DMEM-H培养基稀释）铺于96 孔板中，风干后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤20 min×3次，备用。取对数生长期细胞，以2×105个/mL接种至6孔板中，每孔50 μL。按“2.2.1”项下方法分组、处理。培养24 h后，收集各组细胞，用胰蛋白酶消化并制成单细胞悬液（1×104个/mL）。取上述单细胞悬液100 μL，接种至上述铺有rFN 的96 孔板中，于37 ℃培养1 h；以PBS 洗涤3 次，以甲醇固定10 min 后，用结晶紫染液染色15 min；再以PBS洗涤3次，于显微镜下观察细胞黏附情况并记录黏附细胞（呈紫色）数。

2.2.3 细胞迁移和侵袭能力

取对数生长期细胞，以2×105个/mL 接种至6 孔板中，每孔300 μL。按“2.2.1”项下方法分组、处理。待细胞融合至90%时，用200 μL 移液器枪头在每孔底部中央划一直线。分别于培养0、24 h 时用显微镜观察并拍照，记录对应的划痕面积（S0h、S24h），并按下式计算细胞迁移率：细胞迁移率＝（S0h－S24h）/S0h×100%。

取对数生长期细胞，以不含胎牛血清的DMEM-H培养基制成单细胞悬液（1×105个/mL），取上述单细胞悬液0.25 mL，置于Transwell小室（需用基质胶处理5 h）上层；取含10%胎牛血清的DMEM-H 培养基0.45 mL，置于Transwell 小室下层。上室细胞按“2.2.1”项下方法分组、处理。培养24 h后，弃去上清液，穿膜细胞用PBS清洗3次，以4%甲醇固定30 min后晾干；用0.1%结晶紫染液染色10 min，用PBS清洗3次，晾干。使用显微镜观察、拍照（每孔随机选择5 个不同区域），并使用Image J图像分析软件记录侵袭细胞（呈紫色）数。

2.2.4 细胞EMT相关蛋白的表达情况

取对数生长期细胞，以2×105个/mL 接种至6 孔板中，每孔300 μL。按“2.2.1”项下方法分组、处理。培养24 h 后，收集各组细胞，提取其蛋白后，进行定量、变性处理。取变性蛋白适量，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜，封闭2 h；以TBST缓冲液洗膜，加入E-cadherin、N-cadherin、vimentin、FN、β-actin 一抗（稀释比例分别为1∶2 000、1∶10 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶ 2 000），4 ℃下孵育过夜；以TBST 缓冲液洗膜，加入相应IgG二抗（稀释比例为1∶2 000），室温下孵育2 h；以TBST缓冲液洗膜，加入显影液，使用凝胶成像系统成像并采用Image J 软件进行分析，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。

2.3 安罗替尼对T98G细胞恶性表型影响机制的验证

2.3.1 细胞增殖活力

取对数生长期细胞，以2×105个/mL接种至96孔板中，每孔100 μL。将细胞分为对照组、安罗替尼组、抑制剂组和激活剂组，每组设置3个复孔。对照组细胞不进行干预；安罗替尼组细胞分别用10 μmol/L 的安罗替尼（浓度参考“2.2”项下各实验结果设置）进行干预；抑制剂组细胞用10 μmol/L 的安罗替尼+5 μmol/L 的NF-κB 通路抑制剂BAY 11-7082[8]进行干预；激活剂组细胞用10 μmol/L 的安罗替尼+1 μmol/L 的 NF-κB 通路激活剂prostratin[9]进行干预；同时，设置不加细胞的调零孔作为空白组。培养24 h后，按“2.2.1”项下方法检测各组细胞的增殖活力。

2.3.2 细胞黏附能力

取对数生长期细胞，以2×105个/mL 接种至6 孔板中，每孔50 μL。按“2.3.1”项下方法分组、处理，再按“2.2.2”项下方法检测各组黏附细胞数。

2.3.3 细胞迁移和侵袭能力

取对数生长期细胞，以2×105个/mL接种至6孔板中，每孔300 μL。按“2.3.1”项下方法分组、处理，再按“2.2.3”项下方法检测各组细胞迁移率和侵袭细胞数。

2.3.4 细胞EMT及NF-κB通路相关蛋白表达情况

取对数生长期细胞，以2×105个/mL 接种至6 孔板中，每孔300 μL。按“2.3.1”项下方法分组、处理，再按“2.2.4”项下方法检测各组细胞中E-cadherin、N-cadherin、vimentin、FN、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白（NF-κB p65、p-NF-κB p65的稀释比例分别为1∶5 000、 1∶2 000）的相对表达量。

2.4 统计学方法

采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。计量资料均以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 安罗替尼对T98G细胞恶性表型的影响

3.1.1 细胞增殖活力

与对照组（1.00±0.07）比较，10、20 μmol/L 安罗替尼组和阳性对照组细胞的增殖活力（0.76±0.08、0.53±0.05、0.51±0.03）均显著降低（P＜0.05）；与阳性对照组（0.51±0.03）比较，5、10 μmol/L安罗替尼组细胞的增殖活力（0.90±0.04、0.76±0.08）均显著升高（P＜0.05），而20 μmol/L 安罗替尼组细胞的增殖活力（0.53±0.05）则与阳性对照组相当（P＞0.05）。

3.1.2 细胞黏附能力

与对照组（239.67±10.26）比较，5、10、20 μmol/L 安罗替尼组和阳性对照组的黏附细胞数（179.67±15.31、143.67±10.02、96.00±5.29、94.00±4.58）均显著减少（P＜0.05），且有浓度依赖趋势；与阳性对照组比较，5、10 μmol/L 安罗替尼组的黏附细胞数均显著增加（P＜0.05），而20 μmol/L安罗替尼组的黏附细胞数则与阳性对照组相当（P＞0.05）。结果见图1。

图1 不同浓度安罗替尼对细胞黏附能力的影响

3.1.3 细胞迁移和侵袭能力

与对照组[细胞迁移率为（43.67±2.08）%、侵袭细胞数为42.67±3.79]比较，5、10、20 μmol/L 安罗替尼组和阳性对照组的细胞迁移率[（35.33±2.08）%、（26.33±2.08）%、（19.00±2.00）%、（18.33±1.53）%]和侵袭细胞数（32.00±2.65、27.67±1.53、15.67±1.53、15.67±2.08）均显著降低（P＜0.05），且有浓度依赖趋势；与阳性对照组比较，5、10 μmol/L安罗替尼组的细胞迁移率和侵袭细胞数均显著升高（P＜0.05），而20 μmol/L安罗替尼组的上述指标则与阳性对照组相当（P＞0.05）。结果见图2、图3。

图2 不同浓度安罗替尼对细胞迁移能力的影响

图3 不同浓度安罗替尼对细胞侵袭能力的影响

3.1.4 细胞EMT相关蛋白的表达情况

与对照组比较，各药物组细胞中E-cadherin 蛋白的表达均显著上调，N-cadherin、vimentin、FN 蛋白的表达均显著下调（P＜0.05），且有浓度依赖趋势；与阳性对照组比较，5、10 μmol/L安罗替尼组细胞中E-cadherin蛋白的表达均显著下调（P＜0.05），N-cadherin、vimentin、FN蛋白的表达均显著上调（P＜0.05）；而20 μmol/L安罗替尼组的上述蛋白表达则与阳性对照组相当（P＞0.05）。结果见图4、表1。

表1 不同浓度安罗替尼对细胞EMT 相关蛋白相对表达量的影响（±s，n＝3）

表1 不同浓度安罗替尼对细胞EMT 相关蛋白相对表达量的影响（±s，n＝3）

a：与对照组比较，P＜0.05；b：与阳性对照组比较，P＜0.05。

组别对照组5 μmol/L安罗替尼组10 μmol/L安罗替尼组20 μmol/L安罗替尼组阳性对照组FN 1.41±0.03 1.11±0.06ab 0.84±0.04ab 0.30±0.02a 0.26±0.02a E-cadherin 0.25±0.02 0.40±0.03ab 0.70±0.03ab 0.95±0.03a 1.00±0.03a N-cadherin 0.95±0.02 0.70±0.01ab 0.40±0.02ab 0.16±0.02a 0.13±0.01a vimentin 2.02±0.06 1.90±0.03ab 0.91±0.05ab 0.20±0.01a 0.15±0.02a

图4 不同浓度安罗替尼对细胞EMT 相关蛋白表达影响的电泳图

3.2 安罗替尼对T98G细胞恶性表型影响的机制

3.2.1 细胞增殖活力

与对照组（1.00±0.08）比较，安罗替尼组细胞的增殖活力（0.76±0.07）显著降低（P＜0.05）；与安罗替尼组比较，抑制剂组细胞的增殖活力（0.48±0.02）显著降低（P＜0.05），而激活剂组细胞的增殖活力（1.01±0.08）则显著升高（P＜0.05）。

3.2.2 细胞黏附能力

与对照组（243.00±7.21）比较，安罗替尼组的黏附细胞数（143.67±11.59）显著降低（P＜0.05）；与安罗替尼组比较，抑制剂组的黏附细胞数（73.67±10.50）显著降低（P＜0.05），而激活剂组的黏附细胞数（228.67±13.65）则显著升高（P＜0.05）。结果见图5。

图5 机制验证中各组细胞的黏附能力比较

3.2.3 细胞迁移和侵袭能力

与对照组[细胞迁移率为（43.67±2.08）%、侵袭细胞数为41.33±3.51]比较，安罗替尼组的细胞迁移率[（24.00±1.00）%]和侵袭细胞数（26.67±1.53）均显著降低（P＜0.05）；与安罗替尼组比较，抑制剂组的细胞迁移率[（15.67±1.15）%]和侵袭细胞数（13.33±2.52）均显著降低（P＜0.05），而激活剂组的细胞迁移率[（45.33±1.53）%]和侵袭细胞数（40.00±2.65）则显著升高（P＜0.05）。结果见图6、图7。

图6 机制验证中各组细胞的迁移能力比较

图7 机制验证中各组细胞的侵袭能力比较

3.2.4 细胞EMT和NF-κB通路相关蛋白的表达情况

与对照组比较，安罗替尼组细胞中E-cadherin蛋白的表达显著上调，N-cadherin、vimentin、FN、p-NF-κB p65蛋白的表达均显著下调（P＜0.05）；与安罗替尼组比较，抑制剂组细胞中E-cadherin 蛋白的表达显著上调（P＜0.05），N-cadherin、vimentin、FN、p-NF-κB p65 蛋白的表达均显著下调，而激活剂组细胞中上述蛋白的变化则相反（P＜0.05）。结果见图8、表2。

表2 机制验证中各组细胞中EMT 和NF-κB 通路相关蛋白相对表达量比较（±s，n＝3）

表2 机制验证中各组细胞中EMT 和NF-κB 通路相关蛋白相对表达量比较（±s，n＝3）

a：与对照组比较，P＜0.05；b：与10 μmol/L安罗替尼组比较，P＜0.05。

组别对照组安罗替尼组抑制剂组激活剂组E-cadherin 0.40±0.03 0.60±0.02a 0.95±0.02b 0.40±0.03b N-cadherin 1.41±0.04 0.95±0.02a 0.20±0.01b 1.20±0.02b vimentin 2.30±0.11 1.01±0.07a 0.40±0.03b 2.30±0.06b FN 0.95±0.02 0.77±0.08a 0.25±0.03b 1.15±0.03b NF-κB p65 0.96±0.04 0.96±0.04 0.96±0.05 0.95±0.04 p-NF-κB p65 0.36±0.03 0.27±0.03a 0.19±0.01b 0.43±0.02b

图8 机制验证中各组细胞中EMT 和NF-κB 通路相关蛋白表达的电泳图

4 讨论

脑胶质瘤属于临床常见的具有高死亡率、高发病率特点的中枢神经系统肿瘤。虽然医学治疗水平在不断提高，但脑胶质瘤病灶很难通过手术彻底清除，患者极易复发，且一旦出现转移则难以进行有效治疗。脑胶质瘤细胞有丰富的新生血管，在其侵袭、转移过程中，肿瘤细胞可从原发病灶脱离、降解，随即入侵淋巴管或血管，并经淋巴或血液循环转移至远端形成新的病灶，呈现出高度侵袭性[1]，因此探寻有效抑制脑胶质瘤细胞转移及侵袭的药物具有重要意义。

作为新型口服酪氨酸酶抑制剂，安罗替尼可通过抑制肿瘤血管形成而发挥抗肿瘤作用，现已获批用于肺癌、软组织肉瘤、甲状腺髓样癌等多种适应证，并可使晚期或转移性肝细胞癌、食管鳞癌患者在治疗中获益。研究表明，安罗替尼能抑制肺癌细胞生长和瘤体血管生成，且对人肝内胆管上皮肿瘤细胞HCCC-9810 具有杀伤作用[10]；另有研究指出，安罗替尼联合替莫唑胺化疗可延缓脑胶质瘤患者的疾病进展[11]。本研究结果显示，10、20 μmol/L 安罗替尼组和阳性对照组细胞的增殖活力均显著低于对照组，提示其可抑制脑胶质瘤细胞的增殖；同时，20 μmol/L安罗替尼组细胞的增殖活力与阳性对照组比较差异无统计学意义，提示此剂量的安罗替尼对脑胶质瘤细胞增殖活力的抑制作用与50 mg/L的5-氟尿嘧啶相当，与陈彦民等[12]的研究结果基本一致。

肿瘤细胞的迁移、侵袭与EMT关系密切，其可借助EMT样进程形成有迁移能力的间充质细胞，从而诱导细胞向其他组织和器官转移[13]。有研究证实，EMT 在肾癌、肺癌、乳腺癌细胞原位侵袭和远端转移中发挥了重要作用[14]。作为具有高度侵袭性的恶性肿瘤，脑胶质瘤的发生与细胞间质性改变关系密切[3]。由于EMT 的影响，纤维细胞快速增多，其所含的细胞外基质也不断增多，从而导致了脑胶质瘤的持续恶化发展[15]。本研究结果显示，不同浓度安罗替尼组和阳性对照组细胞黏附、迁移、侵袭能力均较对照组显著增强，且N-cadherin、vimentin、FN 蛋白的表达均较对照组显著下调，E-cadherin蛋白的表达均较对照组显著上调；5、10 μmol/L安罗替尼组的上述指标改善程度均不及阳性对照组，而20 μmol/L安罗替尼组与阳性对照组比较差异均无统计学意义，表明20 μmol/L安罗替尼对脑胶质瘤细胞迁移、侵袭的抑制作用与阳性对照药相当。研究指出，发生EMT 样进程后，肿瘤细胞的迁移和侵袭能力增强，主要表现为E-cadherin、N-cadherin、vimentin等细胞上皮间质分化标志蛋白表达的显著变化[16]。本研究结果提示，安罗替尼具有抑制脑胶质瘤细胞EMT样进程的能力，并可抑制其黏附、迁移和侵袭，与Nan等[17]的研究结果基本一致。

近年研究表明，多种肿瘤的发生发展和NF-κB信号通路的异常激活有关[18]。NF-κB 作为信号通路的中枢，在多种肿瘤细胞EMT 样进程中发挥了重要作用，且抑制肿瘤细胞EMT 样进程能够明显抑制其侵袭、转移[18]。为验证NF-κB 信号通路的作用，本研究在10 μmol/L 安罗替尼的基础上分别联用通路抑制剂BAY 11-7082 和激活剂prostratin 进行验证，结果显示，与安罗替尼组比较，抑制剂组细胞的增殖活力，黏附、迁移、侵袭能力及N-cadherin、vimentin、FN、p-NF-κB p65 蛋白的相对表达量均显著降低，E-cadherin蛋白的相对表达量显著升高，而激活剂组上述指标的变化趋势则相反。以上结果提示，安罗替尼可通过抑制NF-κB信号通路来抑制细胞的EMT样进程，进而抑制脑胶质瘤细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭，说明安罗替尼的抗胶质瘤作用与抑制NF-κB信号通路有关。

综上所述，安罗替尼可抑制人脑胶质瘤T98G 细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭，上述作用可能与抑制NF-κB信号通路进而抑制细胞EMT样进程有关。但本研究只针对NF-κB信号通路进行了研究，该药能否通过其他信号通路发挥抗胶质瘤作用尚需进一步探讨。