酱香型白酒酿造过程中挥发性硫醇类化合物的含量分布

向丹华,李沛祺,王佳宝,陈双,徐岩

(江南大学 生物工程学院,酿造微生物与应用酶学研究室,江苏 无锡,214122)

酱香型作为我国白酒的典型香型,其酿造工艺历经“八次发酵”、“九次蒸煮”、“七次取酒”,生产过程具有“四高两长”(“高温制曲”、“高温堆积”、“高温馏酒”、“生产周期长”、“陈酿贮存时间长”)的典型特征,形成了具有“酱香突出、幽雅细腻、酒体绵柔、回味悠长、空杯留香”的独特风味特点[1]。目前研究表明酱香型白酒香气组分种类十分多样,包括醇类、醛酮类、酸类、酯类、萜烯类、含氮类、含硫类等超过300种。其中挥发性硫醇类化合物由于香气特征独特,香气阈值极低,是酱香型白酒中一类对风味品质具有重要影响的香气化合物[2]。代表性的甲硫醇[3](烂白菜、烧焦的橡胶味,46%酒精水溶液中化合物的香气阈值为2.2 μg/L)、乙硫醇[4](洋葱、橡胶味,46%酒精水溶液中化合物的香气阈值为0.8 μg/L)、2-甲基-3-呋喃硫醇[5](烘烤味,53%酒精水溶液中化合物的香气阈值为0.004 8 μg/L)和糠硫醇[6](烤芝麻、咖啡味,46%酒精水溶液中化合物的香气阈值为0.1 μg/L)等挥发性硫醇类化合物在原酒中含量的变化会显著影响酱香型白酒的风味品质[7]。酱香型白酒轮次基酒的贮存、重新组合形成了复杂而独特的酒体风格[8],轮次基酒的风味特征是保证酱香型白酒品质的重要条件基础,很大程度上决定了成品酒的品质[9]。然而,挥发性硫醇类化合物在酿造过程中研究较少,监测挥发性硫醇类化合物在白酒酿造过程中的规律性变化是实现调控轮次基酒风味品质的重要途径。

由于白酒中挥发性硫醇化合物的含量极低(大多在μg/L或ng/L水平),且不稳定易分解[10],对这类化合物的分析检测十分具有挑战性[11]。往往需要通过特殊的衍生化处理再结合气相色谱联用质谱(gas chromatography mass spectrometry,GC-MS)[12]或液相色谱串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[13]才能有效检测。用于硫醇类化合物检测的衍生化试剂通常有2,3,4,5,6-五氟溴化苄(pentafluorobenzyl bromide,PFBBr)[14]、丙炔酸乙酯(ethyl propiolate,ETP)[15-16]、4,4′-联吡啶二硫醚(4,4′-dithiodipyridine,DTDP)[17]等。衍生化试剂的选择既与检测的目标化合物相关,也与测定样品的基质性质相关,选择合适的衍生化试剂是挥发性硫醇化合物准确检测的关键因素之一。

因此,本研究拟将衍生化与固相萃取(solid phase extraction,SPE)方法结合,联用超高效液相色谱串联质谱(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)检测技术对酱香型白酒中挥发性硫醇类化合物进行定量分析,解析不同酿造轮次的轮次基酒以及不同时间蒸馏出的馏分酒中挥发性硫醇类化合物含量变化规律,可为实现酱香型白酒酿造过程中挥发性硫醇类风味物质的调控提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

本实验采用的样品由某酱香型白酒有限公司提供,包括3组不同生产轮次的基酒样品,以及单一轮次60 min内中不同发酵层(上层、中层、下层)酒醅,经过连续6 min间段蒸馏的基酒。上层和中层取酒时间点为6、12、18、24、30、36、42、48、54、60 min。下层取酒时间点3、9、15、21、27、33、39、45、51、57 min。酱香型白酒的蒸馏阶段,馏出酒的酒精度由高到低逐渐降低。具体样品信息如表1所示。

1.1.2 主要试剂

甲硫醇、乙硫醇、巯基乙酸乙酯、糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇、乙酸3-巯基己酯、2-巯基丙酸乙酯、1-丁硫醇、1-戊硫醇、2-苯乙硫醇(内标),Sigma-Aldrich(上海)或百灵威(北京),纯度均大于95%;C18固相萃取柱(6 mL,500 mg)、2′-脱氧胸苷-5′-二磷酸(2′-deoxythymidine-5′-diphosphate,DTDP)、乙二胺四乙酸二钠(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA-Na2)、盐酸和乙醛,国药集团化学试剂有限公司(上海)或安谱实验科技股份有限公司(上海);甲酸为分析纯,国药集团化学试剂有限公司(上海);乙腈为质谱级,Sigma-Aldrich(上海)。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪、Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪、液相色谱柱(BEH C18 2.1 mm×100 mm,1.7 μm),沃特世科技(上海)有限公司;N-EVAP111型氮吹仪,美国Organomation公司;Milli-Q超纯水系统,美国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1 白酒中挥发性硫醇类化合物的衍生化处理

通常,PFBBr和ETP在碱性pH下与硫醇类化合物进行衍生化反应。然而,白酒的pH值约为4,属于酸性环境,针对白酒进行挥发性硫醇类化合物的衍生化,DTDP是一种非常好的选择,它能与硫醇迅速反应,并且能在较广的pH范围内发生[18]。因此采用衍生化试剂DTDP将白酒中的挥发性硫醇类化合物进行衍生化处理,衍生化试剂的制备过程如下:将220 mg DTDP溶于20 mL超纯水和100 μL浓盐酸(37%质量分数)的混合液中,超声反应溶解后,用超纯水定容至100 mL,制得衍生化试剂(10 mmol/L)。并将DTDP溶液贮存在-20 ℃下备用[19]。

表1 不同生产轮次以及不同时间蒸馏出的酱香型 白酒样品信息Table 1 Information of sauce-aroma baijiu distilled in different production rounds and at different time

使用超纯水或乙醇将白酒酒精度调整至25%vol左右,总体积为40 mL,加入浓度为58.7 mg/L的2-苯乙硫醇溶液68 μL,同时添加EDTA-Na240 mg,50%乙醛160 μL和新鲜解冻的衍生化试剂(4,4′-联吡啶二硫醚,10 mmol/L)400 μL。涡旋振荡5 min后,静置25 min。甲硫醇、乙硫醇、巯基乙酸乙酯、糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇、乙酸3-巯基己酯、2-巯基丙酸乙酯、1-丁硫醇和1-戊硫醇,9种挥发性硫醇类化合物标准品分别配制于20 mL的53%vol酒精水溶液中进行上述前处理过程。

1.3.2 SPE分离白酒中的硫醇的衍生物

将静置后的样品或配制的标准品溶液依次通过使用6 mL甲醇和6 mL超纯水活化处理的C18固相萃取柱。然后用3 mL的甲醇进行洗脱,并收集洗脱液,在常温下使用氮吹仪用温和的氮气流浓缩至400 μL,过膜后避光贮存于4 ℃冰箱中,以待分析。

1.3.3 UPLC-MS/MS 仪器条件设置

采用多反应监测扫描(multiple reaction-monitoring, MRM)模式的正电离模式进行检测。柱温始终保持在40 ℃,流动相为0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈(B),洗脱梯度为:0～13 min, 15%～22% B;13～14 min, 22%～30% B;14～18 min, 30%～35% B;18～18.5 min, 35%～100% B;18.5～21.5 min, 100% B;21.5～22 min, 100%～15% B。流速为0.3 mL/min,进样体积为10 μL。选择以下质谱检测条件:离子源的条件温度为150 ℃,去溶剂温度为500 ℃,毛细管电压3 kV,去溶剂气流速800 L/h。

1.3.4 标准曲线的绘制

参照文献中酱香型白酒中挥发性硫醇类化合物的含量范围[4],确定硫醇类化合物标准品的用量,添加一定量的硫醇类化合物标准品溶解于53%vol乙醇溶液中,依次进行2倍梯度稀释。配制成10个不同浓度梯度的标准品溶液。通过与样品进行相同的前处理方法后进样分析。

1.4 数据分析

UPLC-MS/MS数据使用MassLynx V4.1进行处理。绘图是通过使用Origin Pro 2022b完成。

2 结果与分析

2.1 UPLC-MS / MS 检测酱香型白酒挥发性硫醇类化合物的方法的建立

硫醇类化合物的质谱参数是参考YAN等[4]优化的结果,定量离子对(m/z)、锥孔电压、碰撞电压等质谱信息为甲硫醇(母离子:158.0,子离子:110.7,锥孔电压:23,碰撞电压:19);乙硫醇(172.0,143.0,23,19);1-丁硫醇(199.7,143.4,25,19);1-戊硫醇(214.0,143.2,27,17);糠硫醇(223.7,143.8,21,19),2-甲基-3-呋喃硫醇(224.0,110.6,23,25);巯基乙酸乙酯(230,143.4,25,27);2-巯基丙酸乙酯(244.0,143.2,25,27);乙酸3-巯基己酯(286.2,143.3,23,23)以及内标2-苯乙硫醇(248.5,143.5,23,20)。通过上面得到的质谱信息,采用正离子多反应监测模式进行标准品溶液和样品溶液的检测。根据结果对硫醇类化合物进行标准曲线的绘制,结果见表2。

表2 硫醇类化合物检测的标准曲线Table 2 Standard curves for the detection of thiol compounds

不同的硫醇类衍生物在液相色谱上进行分离,采用乙腈作为有机相,在添加0.1%甲酸后,有了更好的峰形和响应,最终在18 min内的流动相梯度下的完全分离。通过标准品衍生物进样,确定单个硫醇衍生物的出峰时间。将9个硫醇类衍生物的出峰位置整理在同一视图上,如图1所示。

图1 硫醇衍生物UPLC-MS/MS的出峰时间Fig.1 The peak time of thiol derivatives detected by UPLC-MS/MS

2.2 酱香型白酒不同轮次中的挥发性硫醇类化合物的含量分布

酱香型白酒的一个完整的生产过程需要持续一整年(历经8次发酵、9次蒸煮、7次取酒)。在酱香型白酒的生产过程中,挥发性硫醇类化合物作为一类影响酱香型白酒风味品质的重要风味物质,研究不同生产轮次中挥发性硫醇类化合物的含量变化规律对于实现酱香型白酒生产过程中硫醇类风味物质的含量控制具有重要的参考意义。因此,本研究采用3组不同轮次的基酒样品进行检测。3组不同轮次的轮次基酒中,甲硫醇的质量浓度为28.56～746.67 μg/L,乙硫醇的质量浓度为2.97～3.02 μg/L,1-丁硫醇的质量浓度为0.53～3.49 μg/L,1-戊硫醇的质量浓度为0.59～1.87 μg/L,糠硫醇的质量浓度为16.96～26.09 μg/L,2-甲基-3-呋喃硫醇质量浓度为0.65～17.31 μg/L,巯基乙酸乙酯的质量浓度为0.12～0.42 μg/L,2-巯基丙酸乙酯的质量浓度为0.05～0.14 μg/L,乙酸3-巯基己酯的质量浓度为0.16～2.40 μg/L。随着轮次的增加,甲硫醇、糠硫醇和2-甲基-3-呋喃硫醇等重要挥发性硫醇类化合物的含量整体变化有一定上升的趋势,结果如图2所示。

a-甲硫醇;b-糠硫醇;c-2-甲基-3-呋喃硫醇图2 一至七轮次酱香型白酒中甲硫醇、糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇的含量变化Fig.2 The content changes of methanethiol, 2-furfurylthiol, and 2-methyl-3-furanethiol in sauce-aroma Baijiu from one to seven round

2.3 酱香型白酒单一轮次下不同蒸馏时间的硫醇类化合物的含量变化规律

酱香型白酒中的硫醇类化合物整体轮次含量变化规律已经得到解析,为了进一步观察单一轮次蒸馏过程中硫醇类化合物的含量变化规律。酱香型白酒的3组不同发酵层(上层、中层和下层)的不同出酒时间的馏分酒从出酒开始计时,上层和中层,每隔6 min收集馏分,下层从3 min时开始收集第一组馏分,共计30个馏分,进行挥发性硫醇类化合物的检测分析。检测结果如图3～图5所示。在蒸馏阶段,馏分酒中的挥发性硫醇类化合物的含量变化为甲硫醇(61.26～1 204.38 μg/L),乙硫醇(2.98～3.34 μg/L),1-丁硫醇(0.69～17.45 μg/L),1-戊硫醇(0.64～4.72 μg/L),糠硫醇(17.53～80.63 μg/L),2-甲基-3-呋喃硫醇(0.86～20.31 μg/L),巯基乙酸乙酯(0.16～0.47 μg/L),2-巯基丙酸乙酯(0.08～0.36 μg/L),乙酸3-巯基己酯(0.02～3.67 μg/L)。

酱香型白酒上层酒醅的蒸馏过程中,馏分酒中的糠硫醇、2-巯基丙酸乙酯、乙酸3-巯基己酯、1-戊硫醇、巯基乙酸乙酯、1-丁硫醇的浓度变化总体呈现先上升后下降的趋势。甲硫醇总体呈现先降后升的趋势,2-甲基-3-呋喃硫醇总体呈现降低的趋势,乙硫醇含量变化较为稳定。中层酒醅的蒸馏过程中,1-丁硫醇、乙酸3-巯基己酯、2-甲基-3-呋喃硫醇、1-戊硫醇、巯基乙酸乙酯、2-巯基丙酸乙酯的浓度变化总体呈现先上升后下降的趋势,糠硫醇和乙硫醇浓度变化较为稳定。下层酒醅的蒸馏过程中,1-丁硫醇、1-戊硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇、2-巯基丙酸乙酯、巯基乙酸乙酯、乙酸3-巯基己酯浓度变化总体呈现先上升后下降的变化趋势,甲硫醇呈现上升的趋势,糠硫醇和乙硫醇的浓度变化较为稳定。酱香型白酒的三层不同发酵酒醅的馏分中挥发性硫醇类化合物的部分变化规律是不同的,这可能也是酱香型白酒形成3种典型体(酱香、醇甜、窖底香)[20],产生差异的原因之一。

酱香型白酒的三层发酵酒醅在蒸馏过程中,甲硫醇、糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇等重要挥发性硫醇类化合物,其含量变化会出现一个甚至多个拐点。在酒醅的连续蒸馏过程中,硫醇类化合物等风味物质通过蒸馏过程中的萃取作用转移到馏分酒中,其含量并不是一直下降的,这说明挥发性硫醇类化合物在酒醅中的总量并不是恒定不变的,发酵过程中不仅仅只产生含量恒定的挥发性硫醇类化合物,同时也可能产生了一定量的硫醇前体物质[21],在蒸馏加热过程中,前体物质的热降解反应可能增加了挥发性硫醇类化合物的总量。

图3 上层酒醅不同蒸馏时间的馏分酒中挥发性硫醇类化合物的含量变化规律Fig.3 The content changes of volatile thiol compounds in distilled liquor of upper layers fermented grains at different distillation time

图4 中层酒醅不同蒸馏时间的馏分酒中挥发性硫醇类化合物的含量变化规律Fig.4 The content changes of volatile thiol compounds in distilled liquor of middle layers fermented grains at different distillation time

图5 下层酒醅不同蒸馏时间的馏分酒中挥发性硫醇类化合物的含量变化规律Fig.5 The content changes of volatile thiol compounds in distilled liquor of bottom layers fermented grains at different distillation time

甲硫醇和硫化氢可能来源于蛋氨酸或半胱氨酸衍生物的降解[22]。酒醅在发酵过程中含硫氨基酸会大量积累,在蒸馏过程中将酒醅中大量合成的蛋氨酸转化为甲硫醇,通过蒸馏作用萃取到馏分酒中。糠硫醇和2-甲基-3-呋喃硫醇是白酒中重要的硫醇类化合物,它们在酱香型白酒酿造过程中的前体物质可能是糖类和氨基酸,糠硫醇的中间体之一是糠醛和硫化氢[23],2-甲基-3-呋喃硫醇的中间体之一是4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮[24],糠醛和4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮是糖的降解产物。在蒸馏过程中,前体物质发生美拉德反应,最后产生糠硫醇和2-甲基-3-呋喃硫醇,而随着蒸馏的进行,前体物质的减少,中间体物质的消耗,糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇的生成也逐渐缓慢。

3 结论

本研究通过DTDP衍生化结合SPE前处理后进行超高效液相色谱串联质谱检测的方法,对酱香型白酒不同酿造轮次基酒以及单一轮次不同时间蒸馏出的馏分酒中的挥发性硫醇类化合物进行定量分析,确定其含量变化范围并对其含量变化规律进行解析。结果表明,随着轮次的增加,酱香型白酒中香气阈值极低的2-甲基-3-呋喃硫醇、糠硫醇等挥发性硫醇的含量随着轮次的增加而上升,不同轮次间挥发性硫醇类化合物可能存在一定的累积效应,导致下一轮次中硫醇类化合物含量的增加。不同发酵层酒醅的馏分酒中硫醇类化合物的含量变化规律为绝大部分呈现出先上升后下降的变化规律,部分硫醇含量变化稳定,蒸馏过程的热反应促进了甲硫醇、糠硫醇、2-甲基-3-呋喃硫醇等重要挥发性硫醇类化合物的生成。