嗜酸乳杆菌与枯草芽孢杆菌协同发酵玉米淀粉糖渣

2024-02-02李少雷陈旭升张宏建王靓张建华

食品与发酵工业 2024年2期

李少雷,陈旭升,张宏建,王靓,张建华*

1(江南大学生物工程学院,江苏无锡,214122) 2(江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122)

玉米淀粉糖渣是玉米淀粉液化、糖化后压滤得到的残渣,其含有丰富的还原糖、蛋白质和膳食纤维等成分。根据姚宇晨等[1]的预测,到2023年,我国玉米淀粉糖产量将超过2 400万t。相应地,预计每年将产生大约200万t的糖渣。目前,多数企业直接将糖渣作为饲料原料进行销售,但由于糖渣适口性差且含有营养限制因子,导致糖渣的饲喂效率较低[2]。

利用微生物发酵能够提升蛋白含量、改善风味、消除营养抑制因子,是实现糖渣高值利用的有效手段[3]。在玉米淀粉糖渣的发酵方式中,固体发酵具有对设备和发酵环境要求低、能耗低、排废少且利用率高等优势[4]。赵建国[5]以Y9601酵母为出发菌,固体发酵玉米淀粉渣, 通过工艺条件优化,产物酵母数可达7.45×109个/g,表观粗蛋白增加12.7%,真蛋白净增加5.46%,但该方法并不能改善玉米淀粉糖渣的风味、口味;曹磊[6]对玉米淀粉糖渣生产功能性乳酸菌活菌饲料进行了研究,在液态发酵中,将鼠李糖乳杆菌的活菌数由4.10×108CFU/mL提高到1.08×109CFU/mL,达到乳酸菌发挥有益作用要求的菌体密度;还对鼠李糖杆菌的固态发酵工艺条件进行了优化,得到了1.10×109CFU/g的活菌数。前人研究表明,利用糖渣生产乳酸菌制剂是可行的。

本研究以玉米淀粉糖渣为原料,采用枯草芽孢杆菌协同乳杆菌发酵,旨在提高对糖渣中糖的利用率和乳杆菌的活菌数。对双菌发酵进行了种子液接种量、含水量、起始pH、装料量等因素的单因素优化,再选取3个显著影响的条件进行响应面优化,以提高乳杆菌活菌数。对双菌发酵产物和单菌发酵的产物的蛋白质、氨基酸、风味物质、抗营养因子和抗氧化能力进行了分析检测。本研究将为提升玉米淀粉糖渣附加值提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料

玉米淀粉糖渣由山东菱花集团提供;麸皮采购于市场;化学试剂均购于国药集团化学试剂有限公司、北京伊诺凯试剂有限公司,纯度为分析纯。

1.1.2 菌种

嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus),山东威昂生物科技有限公司;枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),北海强兴生物科技有限公司。

1.1.3 培养基

1.1.3.1 种子液培养基

采用LB培养基培养芽孢杆菌;采用MRS培养基培养乳杆菌[7]。

1.1.3.2 固体培养基

固体培养基是将种子液培养基中添加30 g/L的琼脂制备而成。

固态发酵培养基:玉米淀粉糖渣与麸皮质量比1∶1,50%含水量,250 mL三角瓶装料量20 g,起始pH值为7,115 ℃灭菌15 min[8]。

1.2 仪器与设备

UV-1800紫外可见分光光度计,博讯(上海)有限公司;高效液相色谱仪,美国安捷伦有限公司;凯氏定氮仪,山东海能仪器有限公司;味觉分析仪,日本INSENT公司;Heracles II电子鼻,法国Alpha MOS S.A.有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 固态发酵的条件优化

双菌接种比例的优化:乳杆菌接种量5%,再按照乳杆菌与枯草芽孢杆菌的接种比例为5∶0、5∶1、5∶2、5∶3、5∶4(体积比,下同)接种,在37 ℃发酵48 h后,测定发酵物中的乳杆菌活菌数、pH、残糖量。

单因素发酵优化试验:种子液接种量、含水量、起始pH和装料量进行单因素发酵试验,以最高的乳杆菌菌落数为确定因素的最适范围。

为进一步提高乳杆菌活菌数,对前期单因素优化试验中确定的种子液接种量、起始pH和含水量为影响显著影响因素因素,进行响应面优化试验(表1)。

表1 乳杆菌发酵单因素试验因素与水平Table 1 Lactobacillus acidophilus fermentation single factor test factors and levels

乳杆菌发酵工艺响应面优化试验:基于单因素试验结果,以乳杆菌菌落数(Y)为响应值,利用Box-Behnken进行工艺优化设计。根据响应面法建立的数学模型,分析预测乳杆菌最佳发酵工艺条件,对优化的工艺进行验证,对发酵产物进行评价。

1.3.2 乳杆菌计数方法

无菌条件下将样品稀释100倍,200 r/min摇床上振荡15 min,后逐级稀释至10-6,取100 μL稀释后菌液加入平板中,倒双层MRS固体培养基,37 ℃培养48 h,根据菌落数计乳杆菌数[9]。

1.3.3 葡萄糖测定方法:

葡萄糖测定参照SBA法[10]。

1.3.4 氨基酸、植酸、总酚、DPPH自由基清除率测定方法

将样品冷冻干燥后采用高效液相色谱法测定氨基酸含量[11]、双吡啶法测定植酸含量[12]、福林酚法测定总酚含量[13]、分光光度法测定DPPH自由基清除率[14]、凯氏定氮法测定蛋白质含量[15]。

1.3.5 电子鼻测定方法:

样品经冷冻干燥后采用Heracles Ⅱ电子鼻[16]进行分析测定。

1.3.6 电子舌测定方法:

样品经冷冻干燥后采用味觉分析仪[17]分析。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌与乳杆菌双菌试验

曹磊[6]对糖渣的固态发酵研究,发现鼠李糖乳杆菌不能直接利用糖渣中的粗蛋白,外源添加2%(质量分数)的蛋白胨可以促进乳杆菌的增殖。因此,氮源可能是限制乳杆菌在糖渣中增殖的主要因素。然而,外部添加氮源的方法不仅会增加成本并且增加了染菌的风险。ZHANG等[8]利用枯草芽孢杆菌MA139的固态发酵提高路氏乳杆菌G8-5的活力,多菌制剂的最高乳酸菌数目为9.01×109CFU/g,最大芽孢杆菌数目为1.03×1010CFU/g。研究认为枯草芽孢杆菌分泌蛋白酶并水解粗蛋白,为乳杆菌提供氮源,同时因枯草芽孢杆菌生长消耗了氧气,为乳杆菌增殖营造了厌氧环境。

基于上述已有研究结果,本研究尝试在糖渣中按不同比例同时接入乳杆菌和枯草芽孢杆菌。结果(图1)表明,随着枯草芽孢杆菌比例的增加,葡萄糖消耗量先增加后减少,终pH先下降后上升。乳杆菌活菌数在两菌比例为5∶2时最高,为1.50×109CFU/g,比未添加枯草芽孢杆菌(5∶0)时高2.86倍,同时,终pH也因为乳杆菌的生长而降低。随着枯草芽孢杆菌比例的继续增加,导致乳杆菌活菌数下降,表明二者之间的竞争加剧,枯草芽孢杆菌成为优势菌株,这不利于葡萄糖利用率的增加。以上现象说明,适量添加枯草芽孢杆菌可以促进乳杆菌的生长,提高葡萄糖利用率。

2.2 响应面优化试验优化提高乳杆菌数

2.2.1 响应面试验优化试验

固定条件为发酵37 ℃、双菌种子液比例为5∶2、发酵时间为48 h、250 mL三角瓶装料量为20 g。以种子液接种量(A)、培养基含水量(B)、初始pH(C)为响应因子,以乳杆菌菌落数(Y)为响应值,根据Box-Behnken设计3因素3水平优化试验,试验设计见表2,响应面二次模型方差分析见表3。

a-pH;b-葡萄糖含量;c-乳酸菌数图1 枯草芽孢杆菌与乳杆菌接种比例对发酵的影响Fig.1 Effect of Bacillus subtilis to Lactobacillus inoculation ratio on fermentation注:比例为嗜酸乳杆菌:枯草芽孢杆菌种子液体积比。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根据Design Expert分析软件进行回归分析,得到乳杆菌活菌数对接种量、培养基含水量、初始pH的二次回归模型方程:

Y=4.99+0.268 3A-0.048 7B+0.125C-0.11AB-0.207 5AC+0.292 5BC-0.468 8A2-0.328 7B2-0.116 2C2

2.2.2 响应面试验验证的试验

根据响应面法建立的数学模型,分析预测出乳杆菌发酵工艺的最佳条件为:双菌种子液体积比为5∶2,乳杆菌与枯草芽孢杆菌接种量为7.8%,含水量为72%,初始pH为7.26,乳杆菌预测值为5.05×109CFU/g。

根据优化后的工艺条件,在相同的实验条件下,对单菌和双菌发酵进行了测定,以获取乳杆菌的生长曲线,包括菌落数、pH值和残糖。实验结果如图2所示。

结果表明,在经过枯草芽孢杆菌协同发酵后,乳杆菌活菌数明显增加。相较于单一乳杆菌的发酵,双菌发酵的乳杆菌活菌数增加了2.42倍,达到了5.05×109CFU/g。验证与模型预测值相符,说明响应面法优化乳杆菌发酵工艺是可行的,枯草芽孢杆菌和乳杆菌在发酵中具有协同作用。同时,发酵后的pH明显下降,这表明乳杆菌代谢活动增强,导致有机酸的累积。另外,葡萄糖消耗量也显著提高,表明协同发酵的代谢效率更高。

2.3 发酵产物组分分析

2.3.1 发酵产物功能性与抗营养因子等物质的分析

总酚在饲料中起到抗氧化、保护营养成分、提高稳定性和延长保存期的作用[18]。表4结果表明发酵可以显著增加总酚含量,其中双菌发酵的含量高于单菌发酵;植酸是一种抗营养因子,抑制动物肠道对矿物质的吸收,对动物生长和健康有负面影响[19],发酵过程中微生物分泌的植酸酶分解了植酸,使其含量显著降低;饲料清除DPPH自由基的能力越强,其抗氧化能力越强,发酵后的产物更有助于动物肠道健康[20]。发酵后,粗蛋白质、水解氨基酸和游离氨基酸的含量会增加。这种现象一方面是由于总体干重的减少,另一方面则是因为乳杆菌和枯草芽孢杆菌分泌的相关酶作用的结果。综合来看,双菌发酵比单菌发酵的效果更好,二者与未发酵的糖渣相比,营养物质增加、功能性增强和抗营养因子减少。

a-乳酸菌数;b-pH;c-葡萄糖含量图2 单乳杆菌、双菌协同发酵效果对比Fig.2 Comparison of synergistic fermentation effects of Lactobacillus monosis and Lactobacillus monobacterium

表4 功能性与抗营养因子分析表Table 4 Table of functional and anti-nutritional factor analysis

2.3.2 电子鼻风味特征性分析

使用Heracles Ⅱ电子鼻,对糖渣、乳杆菌的单菌发酵物以及双菌的发酵物进行了风味性物质分析(图3)。每个保留时间对应着相应的化合物和相关风味。如表5所示,在保留时间为18.18、24.71 min的潜在可能性组成中,主要成分为二甲硫醚,该物质具有不愉快气味和毒性,另一成分乙硫醇则具有刺激性蒜臭味和微毒性。经过发酵后,这些气味显著减少。在保留时间为52.48、62.70、66.74 min的潜在可能性组成中,主要成分为环己醇、辛酮、庚酸甲酯等具有芳香气味的物质。发酵后,这类物质的含量明显增加。而在保留时间为36.24 min的潜在可能性组成中,主要成分为丁二醇,该物质只在混菌发酵中存在,具有类水果味和奶油味。此外,在保留时间为64.13 min的潜在主要成分中,单菌发酵新增正葵烷等芳香类物质,而混菌发酵则主要新增2-乙基-3-甲基吡嗪,该物质具有强烈的坚果香味。

综上所述,经过发酵后,3种糖渣的气味出现了明显的差异。未发酵的糖渣多为酸臭味等不愉快气味,乳杆菌的单菌发酵物减少了臭味,同时增加了醇和脂类的香味。乳杆菌和枯草芽孢杆菌双菌的发酵物则在减少臭味的基础上,增加了强烈的类坚果香味。单菌发酵和双菌协同发酵都可以改善糖渣的风味,但双菌协同发酵的香味更为浓烈。

图3 电子鼻风味雷达图Fig.3 Electronic nose flavor radar

表5 风味物质成分表

2.3.3 电子舌味道分析

电子舌能感知液体环境中的不同味感,将待测样品的化学信号转化为电信号,电信号通过信号采集单元和模式识别系统转化为电势差,其输出值为电子舌评分[21]。由表6可知,发酵减少了苦味,增加了涩味、苦味回味和涩味回味,分析原因为发酵降解了苦味物质,而又增加了可导致涩味的多酚类物质,使得味道变化;又由于发酵后鲜味氨基酸含量的增加,鲜味也有显著增加,发酵消耗了部分培养基中的糖导致甜味减少,而分泌的乳酸等酸性物质导致酸味也显著增加。王玉[22]对21日龄断奶仔猪进行添加风味剂的研究中,发现联合添加鲜味剂和复合有机酸具有提高采食量的作用。发酵使糖渣味道更偏向于鲜味和酸味,与研究中风味剂相似。