基于形态标记和ISSR分子标记的长瓣铁线莲遗传多样性分析

贾艳艳 邱玉鹏 周欣莹 耿宇航 孙浩男 刘冬云

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.01.008

引用格式：

賈艳艳， 邱玉鹏， 周欣莹，等.基于形态标记和ISSR分子标记的长瓣铁线莲遗传多样性分析［J］.草地学报，2024，32（1）：75-86

JIA Yanyan， QIU Yupeng， ZHOU Xinying，et al.Genetic Diversity Analysis of Clematis macropetala Based on ISSR and Morphological Markers［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（1）：75-86

收稿日期：2023-06-01；返修日期：2023-11-18

基金项目：河北省铁线莲属植物种质资源收集与新种质创制（20326339D）资助

作者简介：

贾艳艳（1996-），女，汉族，河北承德人，硕士研究生，主要从事园林花卉育种栽培方向研究，E-mial：331291361@qq.com；*通信作者 Author for correspondence，E-mial：510297525@qq.com

摘要：为快速区分鉴定市场上繁多的长瓣铁线莲（Clematis macropetala）品种，了解长瓣铁线莲间的遗传多样性水平及亲缘关系，本试验利用形态标记结合ISSR分子标记对25个长瓣铁线莲品种和1个野生种进行遗传多样性研究。结果表明：14个数量形状的变异系数在0.24%～2.32%之间；15个假质量性状的信息多样性指数H在0～2.29%之间，遗传多样性指数D在0～0.94%之间；在欧式距离为15时，可将29个表型性状划分为七类，在欧式距离为15时，可将26个长瓣铁线莲划分为五类。12条引物共扩增出144个条带，多态性条带占比为100%。利用引物UBC815、UBC824和UBC836构建26个长瓣铁线莲的指纹图谱，可快速区分鉴定26个长瓣铁线莲。UPGMA聚类结果显示，在遗传相似系数为0.68时，可将26个长瓣铁线莲划分为八大类。形态标记结合ISSR分子标记可有效鉴别长瓣铁线莲种质资源，以期为长瓣铁线莲种质资源收集保存、创制新品种等提供理论基础。

关键词：长瓣铁线莲；形态标记；ISSR分子标记；遗传多样性；

中图分类号：S682.1+9    文献标识码：A      文章编号：1007-0435（2024）01-0075-12

Genetic Diversity Analysis of Clematis macropetala Based on

Morphological Markers and ISSR Molecular Makers

JIA Yan-yan， QIU Yu-peng， ZHOU Xin-ying， GENG Yu-hang， SUN Hao-nan， LIU Dong-yun*

（Hebei Agricultural University Baoding， Baoding， Hebei Province 071000， China）

Abstract：This experiment aimed to quickly distinguish and identify the varieties of Clematis macropetala on the market，and to understand diversity and relationships among 26 Clematis macropetala samples.The experiment used morphological markers combined with ISSR molecular markers to study genetic diversity and phylogenetic relationships among 26 Clematis macropetala.The results showed that the variation coefficient of 14 quantitative shapes ranged from 0.24% to 2.32%，with an average coefficient of variation of 0.29% for leaf indicators and 0.64% for flower indicators.The information diversity index H of 15 quality traits ranged from 0 to 2.29%，and the genetic diversity index D ranged from 0 to 0.94%. At a European distance of 15，29 phenotypic traits were divided into 7 categories，and at a European distance of 15，26 samples of Clematis macropetala were divided into 5 categories. The total of 144 bands were amplified using 12 primers，with a polymorphism rate of 100%. Using primers UBC815，UBC824，and UBC836 to construct fingerprint maps of 26 Clematis macropetala，26 Clematis macropetala were quickly distinguished and identified. The UPGMA clustering analysis results showed that when the genetic similarity coefficient was 0.68，26 Clematis macropetala could be divided into 8 categories.Phenotypic traits combined with ISSR molecular markers could effectively identify the germplasm resources of Clematis macropetala. These research results provided a theoretical basis for the collection and preservation of Clematis macropetala germplasm resources，as well as the creation of new varieties.

Key words：Clematis macropetala;Morphological markers;ISSR molecular markers;Genetic diversity

铁线莲属（Clematis）植物具有较高的观赏价值和应用价值，常被用于植物园、公园和家庭花园等地的装饰绿化［1-3］。长瓣铁线莲为攀援藤本花卉，花形奇特，呈钟状到碗状，蓝紫色花色在自然界中较为少见，外轮雄蕊不育，多瓣化，花瓣状退化雄蕊数量众多。长瓣铁线莲是很好的花卉装饰材料，在国外被广泛应用于园林的垂直绿化，可配植于假山或岩石园中，亦可做切花、瓶插、盆景等应用，但在国内鲜有应用［4-5］。

遗传标记主要有4种，即形态标记（Morphological marker）、细胞标记（Cytological marker）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（Molecular marker）［6］。4种标记方法各有利弊，结合2种或2种以上标记方法可提高结果可靠性。董媛等［7］利用形态标记对河南洛阳9种常见栽培芍药（Paeonia lactiflora Pall.）品种进行了分类；李晓慧等［8］对17份叶菜用甘薯（Dioscorea esculenta）进行形态标记研究时表明，由于环境因素影响，形态标记在多数植物中多态性较差，存在表现型不同而遗传物质相同，或表现型相同而遗传物质不同等情况，需结合分子标记进行深入研究。

王楠等［9］以铁线莲园艺品种‘Gravetye Beauty为研究对象，应用ISSR分子标记技术建立了最优ISSR-PCR反应体系。和文志等［10］以16个铁线莲品种为试验材料，采用ISSR分子标记技术研究了16个品种的遗传多样性。王鑫等［11］以河北省17个野生铁线莲为试验材料，采用ISSR和rDNA-ITS标记方法鉴定了17个野生种间的亲缘关系。余伟军等［12］以32个铁线莲属植物为试验材料，采用ISSR分子标记技术研究了32个试验材料间的遗传多样性。铁线莲属植物约有300种之多，经过育种专家长期的繁殖培育，很多早已无法追溯遗传背景。为解决铁线莲属植物遗传背景模糊复杂的问题，前人多从形态学和细胞学上对铁线莲属植物进行了遗传多样性及亲缘关系研究［13-17］，但对于分子生物学的相关研究报道较少。常用的分子标记方法有RAPD（随机扩增多态性DNA）、SRAP（相关序列扩增多态性）、SSR（简单重复序列）、ISSR（简单序列重复区间）、及ITS序列等，与其他分子标记技术相比，ISSR分子标记技术具有多态性丰富，易操作，稳定性高的优点，被广泛应用于植物品种鉴定、遗传多样性和系统发育等研究中［18-20］。

本试验对26个长瓣铁线莲进行形态及ISSR分子标记遗传多样性研究，探究长瓣铁线种质资源的遗传多样性水平及亲缘关系，以快速区分鉴定市场上繁多的长瓣铁线莲品种，为ISSR分子标记技术在长瓣铁线莲品种分类测评鉴定、遗传多样性评价、亲缘关系分析等方面研究提供理论依据。形态标记结合ISSR分子标记可有效鉴别长瓣铁线莲种质资源，研究结果可为长瓣铁线莲种质资源收集保存、创制新品种等提供理论基础。

1  材料与方法

1.1  材料

26份供试材料由课题组于2019—2021年收集自国内外，每个品种（野生种）引种10株，种植于河北农业大学试验基地，种植基质为进口草炭∶珍珠岩∶10～15 mm树皮=3∶1∶1。供试材料相关信息详见表1。

1.2  方法

1.2.1  形态数据测量  参考《植物新品种特异性、一致性、稳定性测试指南铁线莲》［21］选取29个表型性状，其中数量性状14个（表2），假质量性状15个（表3）。表型性状的数据获取于盛花期及叶片成熟期2个阶段进行，每个品种选取10株长势基本一致的植株进行性状调查，盛花期进行花的相关性状测量调查，叶片成熟期进行叶的相关性状测量调查。

1.2.2  DNA的提取与检测  DNA的提取采取试剂盒法（CW0531S，康为世纪），DNA纯度采用微量紫外分光光度计进行检测，要求其纯度（OD260/OD280）在1.6～2.0之间，剔除不合格的样本重新提取至合格。将DNA母液浓度稀释成40 ng·μL-1的工作液，1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测［10］。

1.2.3  ISSR引物筛选及PCR扩增  参照王鑫等［11］筛选出的12条引物进行试验。12条引物相关信息见表4。

ISSR-PCR反应体系为25.0 μL，具体包括：1.0 μLDNA工作液、2.0 μL引物、12 μL 2× Es Taq Master Mix、10 μLddH2O。

ISSR-PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性50 s；50℃退火1 min；72℃延伸1 min；36个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.2.4  数据处理

（1）形态指标数据处理

利用Excel 2019对调查测定的表型性状数据进行整理，计算14个数量性状的最小值、最大值、极差、平均值、标准差和变异系数；计算15个假质量性状的分布频率及Shannon-Wiener信息指数H（H=1-∑in=iPilnPi）和Simpson遗传多样性指数D（D=1-∑in=1P2i），式中：Pi为某一性状第i级内材料份数占总份数的百分比。利用SPSS26.0基于欧式遗传距离（Euclidean distance）对29个表型性状进行R型聚类分析，对26个长瓣铁线莲品种（种）进行Q型聚类分析。

（2）ISSR分子标记数据处理

依据人工读带原则，同一引物扩增出来的条带，在同一位置上出现清晰无拖带条带记为“1”，无条带记为“0”，建立0，1矩阵。利用NTsys软件计算遗传相似系数，使用UPGMA法绘制聚类分析图［22］。使用POPGENE軟件计算等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannons多样性信息指数（I）、Neis基因多样性指数（H）等指标。选择具有良好多态性位点的引物，构建26个长瓣铁线莲的指纹图谱［23］。

2  结果与分析

2.1  形态标记遗传多样性结果与分析

2.1.1  14个数量性状的多样性分析  由表5可知，14个数量形状的变异系数在0.24%～2.32%之间，其中复叶长，复叶宽和萼片长的变异系数均最小，为0.24%；花瓣状退化雄蕊数量的变异系数为2.32%，表明花瓣状退化雄蕊的变异较为丰富，长瓣铁线莲品种‘粉红玛卡的花瓣状退化雄蕊数量为0，而海洋珍珠的花瓣状退化雄蕊数量最多可达311个。叶指标的平均变异系数为0.29%，花指标的平均变异系数为0.64%，可见长瓣铁线莲花的变异较为丰富。

2.1.2  15个假质量性状的多样性分析  由表6可知，15個假质量性状的信息多样性指数H在0～2.29%之间，遗传多样性指数D在0～0.94%之间，叶片形状、叶片顶端形状、叶片基部形状、萼片上表面主要颜色、萼片下表面主要颜色、萼片上表面颜色分布（1种颜色）、萼片上表面次色分布（两种以上颜色）、萼片边缘波状程度、花瓣状退化雄蕊主要颜色，9个指标的H和D值均较高，表明这些指标在26个长瓣铁线莲中表现出较高的遗传多样性。

2.1.3  基于表型性状的聚类分析

（1）29个表型性状的R型聚类分析

由图2可知，在欧式遗传距离为15时，可将29个表型性状划分为七大类，第一类包括萼片上、下表面主要颜色等4个假质量性状；第二类包括叶片顶端形状和叶片基部形状两个假质量形状；第三类包括的表型性状数量最多，包含花瓣状退化雄蕊长度、花瓣状退化雄蕊宽度、株高等16个表型性状；第四类包括花量和叶片形状两个表型性状；第五类包括花瓣状退化雄蕊数量、萼片基部形状和萼片上表面颜色分布（1种颜色）3个性状；第六类仅包含萼片边缘起伏；第七类仅包含萼片上表面次色分布（2种以上颜色）。

（2）26个长瓣铁线莲的Q型聚类分析

由图3可知，在欧式距离为15时，可将26个长瓣铁线莲样本划分为五大类，第一类包括‘梅德威尔、‘弗朗姬和‘拉古等11个样本；第二类包括‘粉红火烈鸟、‘紫色惊喜和‘乡村玫瑰等5个样本；第三类仅包含‘珍珠海洋；第四类包括‘黄金之梦、‘粉色秋千和‘柠檬之梦等8个样本；第五类仅包含‘金色斯托尔维克。第一类的11个长瓣铁线莲花色均为蓝紫色，花瓣状退化雄蕊数量较多，重瓣较高。第三类的‘珍珠海洋花形最为独特，既无雄蕊亦雌蕊，花瓣状退化雄蕊数量100多。第五类的‘金色斯托尔维克叶色为金黄色，与其他长瓣铁线莲存在显著差异。

2.2  ISSR分子标记遗传多样性结果与分析

2.2.1  DNA提取与检测  26个样本DNA的电泳检测，结果显示样本DNA母液电泳结果均为一条清晰明亮的条带，26个样本纯度高满足后续反应对模板DNA的质量要求（图4）。

2.2.2  ISSR引物筛选及扩增结果  12条引物共扩增出144条清晰条带，其中特异性条带144条，每个引物平均扩增出12个位点，平均特异性位点12个，多态性比率达到100%（表7）。12条引物可扩增出6～17条数量不等的条带，扩增条带片段大小为200～2 000 bp，其中，引物UBC815扩增出数量最多的多态性条带（图5），为17条。引物U844扩增出数量最少的多态性条带，为6条。利用POPGENE分析26份长瓣铁线莲样本DNA多样性，铁线莲等位基因数（Na）为1.993 1，有效等位基因数（Ne）为1.293 4，Neis基因多样性指数（H）为0.201 4，Shannons多样性信息指数（I）为0.336 2，表明26个长瓣铁线莲具有较高的DNA多态性和丰富的遗传多样性。

2.2.3  26个长瓣铁线莲的ISSR聚类结果  利用12条引物扩增出来的144个条带构建0、1矩阵，导入Ntsys建立26个长瓣铁线莲种质资源遗传相似系数矩阵（表8），26个供试样本的遗传相似系数在0.052 6～0.477 3之间，平均相似系数为0.20，说明26个长瓣铁线莲间具有较高的遗传多样性。其中，‘金色斯托尔维克和‘紫色惊喜的遗传相似系数最小为0.052 6，表明二者之间亲缘关系较远；从形态学角度来看，二者间的确存在较大差异，‘金色斯托尔维克叶色为黄绿色，叶型为倒卵圆形，叶片边缘为圆齿状，花色为蓝紫色，萼片形状为椭圆形；‘紫色惊喜叶色为浅绿色，叶型为披针形，叶片边缘为锯齿状，花色为紫色，萼片形状为披针形。

‘塞西尔和‘弗朗姬的遗传相似系数较大为0.477 3，说明两者间具有较近的亲缘关系；形态标记聚类时，二者同样被划分为一类，‘塞西尔和‘弗朗姬的大多形态指标相近，例如叶片颜色为浅绿色，叶片形态相近，幼枝都被稀疏短绒毛，叶片均被毛，花朵均具淡香，花朵大小相近，萼片排列方式均为相接，萼片先端均不反折，形状均为急尖，萼片纵切面形状均为凸状，萼片边缘无起伏，萼片及花瓣状退化雄蕊主要颜色均为蓝紫色等。

综合26个供试样本的遗传相似系数，‘金色斯托尔维克与其他的样本间的遗传相似系数较小，在0.05～0.31之间，说明‘金色斯托尔维克与其他品种及野生种的亲缘关系较远，在形态标记聚类时‘金色斯托尔维克单独被划分为一类。26个样本的UPGMA法的聚类结果表明，在相似系数为0.68处，可将26个长瓣铁线莲划分为八类（图6）。其中，‘黄金之梦划分为第一类，‘琥珀划分为第二类，阜平长瓣铁线莲划分为第三类，‘乡村玫瑰划分为第四类，‘峭壁划分为第五类，‘金色惊喜，‘紫色惊喜，‘柠檬之梦划分为第六类，‘拉古划分为第七类，其余17个品种划分为第八类。

聚类结果显示‘金色斯托尔维克与其他16个品种被划分为一类，且与‘紫色之梦亲缘关系较近，从形态学角度来看，‘金色斯托尔维克叶色为黄绿色，叶型为倒卵圆形，叶片顶端形状为急尖，叶片基部形状为楔形，花色为蓝紫色，萼片形状为椭圆形，花瓣状退化雄蕊数量较少；而‘紫色之梦叶色为淡绿色，叶型为卵圆形，叶片顶端形状为卷须状，叶片基部形状为钝圆形，花色为紫粉色，萼片形状为卵圆形，花瓣状退化雄蕊数量相对较多，但形态聚类‘金色斯托尔维克被单独划分为一类，形态学聚类与分子学聚类存在差异。

2.2.4  26个长瓣铁线莲的ISSR指纹图谱构建  为快速区分鉴定26个长瓣铁线莲，利用多态性高、条带清晰的ISSR引物UBC815，UBC824和UBC836构建26个长瓣铁线莲的数字指纹图谱（表9）。

3  讨论

物种的遗传多样性是其长期进化的结果，也是其生存、适应和发展的前提，遗传多样性在物种形态、分子水平上均有所表现，丰富的遗传多样性是宝贵的基因资源［24-25］。形态标记表现直观，易于调查测量，其变异系数和多样性指数反映了种质间性状的离散程度和多样性，是研究植物遗传多样性的重要方法［26］。沈瑶等［27］在研究30个盆栽菊（Chrysanthemum×morifolium Ramat.）品種形态遗传多样性时发现，性状变异系数为14.67%～78.25%，最低和最高变异系数分别为冠幅和舌状小花数，表明盆栽菊品种表型变异丰富。本试验中长瓣铁线莲复叶长，复叶宽和萼片长的变异系数均最小，为0.24%；花瓣状退化雄蕊数量的变异系数为2.32%，表明花瓣状退化雄蕊的变异较为丰富，叶指标的平均变异系数为0.29%，花指标的平均变异系数为0.64%，长瓣铁线莲花的变异较丰富。

ISSR分子标记多态性丰富、灵敏度高和稳定性高，被广泛应用于植物遗传多样性研究［28］。Ma等［29］对175种金丝桃属（Hypericum Linn）植物利用ISSR分子标记法研究其遗传多样性水平，结果表明，ISSR分子标记技术可有效鉴别175种金丝桃属植物，17个欧洲种的遗传相似系数在0.617～0.911间。本试验的26个长瓣铁线莲遗传相似系数在0.05～0.48之间，平均相似系数为0.20，表明26个长瓣铁线莲间具有较远的亲缘关系，26个样本的等位基因数（Na）为1.993 1，有效等位基因数（Ne）为1.293 4，Neis基因多样性（H）为0.201 4，Shannons多样性信息指数（I）为0.336 2，表明26个长瓣铁线莲具有较高的遗传多样。12条多态性较高的ISSR引物共扩增出144个位点，多态性比率达100%，表明ISSR分子标记技术可有效鉴别长瓣铁线莲种质资源，结果显示，不同长瓣铁线莲种质资源具有较高的遗传多样性和复杂的遗传背景，引物UBC815，UBC824，UBC836构建的26个长瓣铁线莲指纹图谱可快速区分鉴定26个样本。胡霞等［30］则发现杏（Prunus armeniaca L.）的野生种群间具有较高的遗传多样性水平，群体内遗传分化水平较高，群体间遗传分化水平较低。对比王鑫等［11］的研究结果发现，引物UBC824对河北易县野生的长瓣铁线莲PCR扩增电泳图谱与本研究的扩增图谱存在差异，推测可能与材料取材于不同地区有关，长瓣铁线莲野生居群间同样可能存在遗传多样性。

本研究基于表型性状和ISSR分子标记技术对26个长瓣铁线莲进行聚类分析，表型性状聚类将26个长瓣铁线莲样本划分为5类，而ISSR分子标记聚类，将26个长瓣铁线莲划分为八类，其中包括‘金色惊喜、‘紫色惊喜、‘梅德威尔和‘吉斯卡等13个品种的形态聚类和ISSR分子聚类结果相同，另外13个长瓣铁线莲两种方法聚类结果差异较大，在形态聚类中‘珍珠海洋和‘金色斯托尔维克分别被单独划分为一类，但在ISSR分子聚类中‘金色之梦、‘琥珀、‘乡村玫瑰、‘峭壁、‘拉古及野生长瓣铁线莲分别被单独划分为一类。形态标记和ISSR分子标记聚类结果不完全相同，这与前人的研究报道一致［31-33］。造成这两种分类方法结果不一致的原因是多方面的，首先，长瓣铁线莲遗传背景复杂，本研究利用的形态性状不足、单一的分子标记探查到的遗传差异有限，不能全面反映品种的遗传信息；其次，形态标记由基因和环境的共同作用，长瓣铁线莲形态容易受到环境因素影响。结合两种聚类方法可初步确定26个长瓣铁线莲的聚类，由于形态标记易受环境影响，且突变对形态标记会产生不利影响，故推测ISSR分子聚类较为准确。Ismail等［34］利用ISSR、SSR，两种标记方法对57种火炬姜（Etlingera elatior）种质进行了分子特征评价，表明不同分子标记的组合的研究更具可靠性。为提高试验结果准确性，在之后的工作中将加入其他的分子标记方法进行佐证，结合多种标记方法，综合运用多种评价体系，更有利于反应长瓣铁线莲遗传多样性水平。

4  结论

形态标记结合ISSR分子标记可有效区分鉴定长瓣铁线莲种质资源，两种标记方法均表明26个长瓣铁线莲样本具有较高遗传多样性水平，本试验可为长瓣铁线莲种质资源收集保存、创制新品种等提供一定的理论基础。

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（责任编辑  彭露茜）