黄芪多糖对斑点叉尾的药效学及安全性临床评价

2024-02-01程安达艾晓辉杨移斌

淡水渔业 2024年1期

程安达，艾晓辉，于江，杨移斌

(1.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223；2.北京生泰尔科技股份有限公司，北京 102600；3.赤峰市农牧业综合检验检测中心，内蒙古赤峰 024000)

黄芪多糖(Astragaluspolysaccharides，APS)是从黄芪植物的根部提取的多糖成分，包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等，具有免疫调节作用[10]，能够广泛提高机体免疫功能，而其同时又具备自然资源丰富、价格低廉、毒性弱及无残留等优势[11]，因此常作为免疫增强剂应用于医疗、畜牧行业。目前，很多研究显示，黄芪多糖可以有效激活水生动物如中华鳖(Pelodiscussinensis)、杂交鳢(Channamaculate♀×Channaargus♂)及齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenanti)等[12-14]非特异性免疫，增强其抗感染能力。因此，本研究拟开展黄芪多糖对斑点叉尾的药效学及安全性临床评价，为其在斑点叉尾中的应用打下坚实的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验药物：黄芪多糖(APS)，由爱迪森(北京)生物科技有限公司提供，兽药生产批准文号：兽药字(2009)010125236，生产批号：1108071；含量：每1 g含黄芪多糖应不少于450 mg。

对照药物：芪参散(Qishen San，Qs)，购自成都通威三新药业有限公司，批准文号：兽药字(2007)220309219 ，生产批号：11071502。

1.2 方法

1.2.1 含黄芪多糖和芪参散饲料的制作

按试验设计的剂量准确称取各组试验和对照药物，分别加入到适量洁净水中，用玻璃棒搅拌混合均匀，转移至小型喷壶中；称取正常斑点叉尾膨化颗粒饲料(武汉通威股份有限公司提供)，均匀铺在预先准备好的塑料薄膜上，使饲料在塑料薄膜上呈薄薄的一层。将配制好的药液喷洒在饲料表面，并充分混匀，在阴凉避光处风干；将制作好的药饲每组分成7等份，4 ℃冰箱中保存，待试验鱼驯化至吃食正常后每4 d使用1份。

1.2.2 II期临床实验

(1)试验设计及分组

将驯养1周体质量(20.00±0.56)g的规格一致、体格健壮、采食活跃、无病无伤的斑点叉尾随机分为6个组，即空白对照组、对照药物组和4个剂量试验组，每组各设置3个平行，每个平行30尾。空白组对照组投喂正常日粮，对照药物组投喂添加芪参散(1 kg鱼体重添加0.1g)的日粮，试验组按每千克鱼体重添加5、10、20及40 mg黄芪多糖。试验周期为28 d，每天投喂2次，每次按鱼体重3%～5%进行投喂。

(2)血样采集

对照组和试验组连续投喂7 d，在第7、14、21、28 d进行尾静脉采血，取样时分别从各组随机取3尾鱼，从尾静脉取血。将所得的血液分为2份，其中1份以1%肝素抗凝，用于血液白细胞吞噬活性的测定，另1份于4 ℃条件下以4 000 r/min离心10 min，收集血清，用于测定血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)。

(3)吞噬原准备及白细胞吞噬活性的测定

将华中农业大学赠送的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)接种在FWA培养基(淡水鱼类琼脂)中，37 ℃下培养24 h后，2 500 r/min离心5 min集菌，然后在金黄色葡萄球菌菌液中加入终浓度为0.5%的福尔马林，37 ℃下灭活24 h。经过平皿法证实此菌已被彻底灭活，用灭菌生理盐水清洗3次，并调成浓度为1.0×105CFU/mL的菌悬液，即为福尔马林灭活的金黄色葡萄球菌菌体(formalin killedS.aureus，F-SA)，置4 ℃冰箱中保存备用。

血液白细胞吞噬活性的测定参照陈昌福等[15]的方法并加以改进。即将0.2 mL抗凝血加入约0.l mL的金黄色葡萄球菌悬液，充分混匀后置于28 ℃下水浴，孵育45 min。水浴期间每隔10 min摇匀1次。用吸管吸取血细胞涂片，每个血样涂5片。自然晾干后，滴加甲醇固定3 min，蒸馏水冲洗，瑞士-吉姆萨混合染色5～10 min，迅速用蒸馏水冲洗，晾干。油镜观察，按下式分别计算吞噬百分比和吞噬指数：

吞噬百分比(PP)=(100个吞噬细胞中参与吞噬的细胞数/100)×100%

吞噬指数(PI)=吞噬细胞内的细菌总数/参与吞噬的吞噬细胞数

(4)血清相关酶指标测定

血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)的测定所用试剂盒均购自南京建成生物技术研究所，严格按照其说明书进行操作。

1.2.3 III期临床试验

(1)试验地点与试验分组

分别选择湖北省仙桃市龙华山办事处付光明养殖场的4个池塘及湖北省宜都市青林寺清江名优鱼专业合作社4个网箱用于试验，4个池塘及4个网箱的位置、面积、环境条件基本相似，分别命名为1#、2#、3#及4#与。每个试验池或网箱相对独立，1#、2#设为对照药物组(芪参散，每日按100 mg/kg鱼体重的剂量拌饲投喂)，3#、4#设为推荐剂量组(黄芪多糖，每日按20 mg/kg鱼体重的剂量拌饲投喂)，其它未用药池塘或网箱为自然的空白对照组。池塘面积皆为7 333 m2，水深1.4～1.5 m；试验期间测得各试验池的水温22～26 ℃、溶解氧≥5 mg/L、pH 6.8～7.0、氨氮≤0.05 mg/L、亚硝酸盐≤0.05 mg/L。4口池塘皆主养斑点叉尾1龄鱼种，每池投放鱼种12 万尾，平均体重25 g/尾，规格整齐，无病无伤。

网箱面积皆为4 m×5 m，深3.5 m；试验期间测得各试验水体的水温18～22 ℃、溶解氧≥5 mg/L、pH 7.0～7.2、氨氮<0.05 mg/L、亚硝酸盐<0.05 mg/L。4只网箱皆单养斑点叉尾1龄鱼种，每池投放鱼种2 000 尾，平均体重50 g/尾，规格整齐，无病无伤。

两个试验点每组均每天早上9：00 和下午16：00分别饲喂一次，每日按体重的3%～5%进行投喂，以饱食为准。

(2)观察指标

各组投喂7 d后停止喂食，并连续观察至15 d。记录每天各组受试斑点叉尾的采食量、应激、活动状态、症状等，在第15 d抽样测定血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)、溶菌酶(LSZ)、碱性磷酸酶(AKP)，取样及测定方法与1.2.1(4)所述一致，记录每天的死亡数。

(3)生产性能指标

试验开始时抽取30 尾鱼测量初体重，试验结束后抽取30尾鱼测定末体重，并计算生产性能。

增重(WG)=FW-IW

增重率(WGR)= WG/IW×100%

特定生长率(SGR)=(lnFW-lnIW)/t×100%

注：IW：初体重，FW：末体重，t：养殖时间。

(4)攻毒试验

病原菌的准备：实验所用的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)购自中科院水生生物研究所，将菌株接种在TSB培养基中，30 ℃下培养24 h后，5 000 r/min离心10 min收集菌体。用0.15 mol/L灭菌生理盐水稀释菌体至液体培养原体积，活菌计数法测定菌液浓度，用灭菌生理盐水将菌液浓度调至为1.0×108CFU/mL，将菌液保存于4 ℃冰箱。

免疫保护率RPS=[1-(试验鱼死亡率/对照鱼死亡率)]×100%

1.2.4 安全性评估

(1)试验设计及观察

将驯养1周的规格一致、体格健壮、采食活跃、无病无伤的斑点叉尾随机分为4个组，即空白对照组、推荐剂量组(1倍)、3倍推荐剂量组、5倍推荐剂量组，空白组投喂正常日粮，试验组按剂量添加黄芪多糖，用药21 d。每个浓度各设3个重复，每个重复20尾。观察和记录斑点叉尾的一般健康情况、中毒表现和死亡过程，包括呼吸频率、外观体征、行为活动、摄食量等。测定并记录试验前及试验结束时动物体重。用药停止后4 h(0 d)和第21天进行斑点叉尾血液生理指标、血液生化指标取样检验。血液样品采集使用一次性无菌注射器尾静脉抽血，注入添加1%肝素钠的采血管中，取全血用贝克曼Coulter LH750全自动血细胞分析仪进行血常规测定，血液生化指标采用日本Sysmex，Chenix-180 多功能生化分析仪。血液生理检测参数主要有血红蛋白(HGB)、红细胞数(WBC)、白细胞数(HTC)、血小板数(PLT)等；血液生化检测参数有总胆固醇(TCH)、肌酐(CRE)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、血清总蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)及血清尿素氮(BUN)等。

(2)剖检和组织病理学检查

1.3 数据分析及处理

试验数据用SPSS 16.0软件包进行方差分析、显著性及相关性检验，结果用平均数±标准差(mean±SD)表示，P<0.05表示差异显著，P< 0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。

2 研究结果

2.1 II期临床试验研究

由图1可知，在7、14、21 d添加5 mg/kg黄芪多糖对白细胞吞噬百分率(PP)和吞噬指数(PI)差异不显著；添加10 mg/kg黄芪多糖的实验组在各时间点对白细胞吞噬百分率(PP)和吞噬指数(PI)差异显著高于空白对照组；添加20、40 mg/kg黄芪多糖的实验组各时间点对白细胞吞噬百分率(PP)和吞噬指数(PI)差异极显著高于空白对照组。添加10、20、40 mg/kg黄芪多糖的实验组各时间点与对照药物组相比，差异不显著。

图1 不同剂量黄芪多糖对斑点叉尾血液中白细胞吞噬活性的影响Fig.1 Effect of each group of drugs on leukocyte phagocytosis activity in blood of I.punctatus

由图2A可知，添加黄芪多糖的四个实验组总超氧化物歧化酶的活力都高于空白对照组，其中，实验至第7、28天时，添加10、20和40 mg/kg组T-SOD活力与空白对照组相比差异显著；除添加5 mg/kg组T-SOD活力比对照药物组低以外，其余三个实验组T-SOD活力与对照药物组相比差异不显著。

图2 黄芪多糖对斑点叉尾血清总超氧化物歧化酶T-SOD、过氧化氢酶CAT和溶菌酶LSZ、酸性磷酸酶ACP和碱性磷酸酶AKP活力的影响Fig.2 Effect of APS on the activities of total superoxide dismutase，catalase，lysozyme，acid phosphatase and alkaline phosphatase in serum of I.punctatus

由图2B可知，添加黄芪多糖的四个实验组除5 mg/kg组外，其余三个实验组过氧化氢酶CAT的活力都高于空白对照组，其中，添加10 mg/kg实验组在第21天，其CAT活力与空白对照组相比，差异显著，添加20 mg/kg实验组在第7、14、21、28天，其CAT活力与空白对照组相比，差异均极显著，添加5 mg/kg组CAT活力比对照药物组低，其余三个实验组CAT活力与对照药物组相比差异不显著。

由图2C可知，四个黄芪多糖添加组溶菌酶活力都比空白对照组有不同程度的提高，实验至第21天以后各组溶菌酶的活力比第14天前有所提高。实验至第21、28天时，添加10 mg/kg和20 mg/kg两个实验组LSZ活力与空白对照组相比，差异均极显著，四个实验组LSZ活力与对照药物组相比差异不显著。

由图2E可知，饲料中添加不同剂量的黄芪多糖在一定程度上提高了斑点叉尾血清碱性磷酸酶的活力，且同一组碱性磷酸酶的活力随着时间的延长而增加，至用药后第21天时达到最大，随后稍微有所降低。至第21天时，添加量为20 mg/kg实验组AKP活力与空白对照组相比差异显著，除添加量为5 mg/kg实验组AKP活力比对照药物组低以外，添加量为10、20和40 mg/kg 三个实验组AKP活力与对照药物组相比差异均不显著。

2.2 III期临床试验研究

表1 黄芪多糖对斑点叉尾T-SOD、LSZ及AKP活性的影响Tab.1 Effect of APS on T-SOD，LSZ and AKP activities of I.punctatus

试验地点组别T-SODLSZAKP空白对照组72.53±1.723.22±0.4335.30±2.75仙桃市付光明养殖场对照药物组90.67±1.13*4.08±0.15*38.12±3.10*推荐剂量组97.79±0.92*4.11±0.12*39.33±1.91*空白对照组74.30±1.613.39±0.4234.39±2.36宜都市廖斌远养殖场对照药物组93.58±1.28*4.30±0.24*38.12±0.97*推荐剂量组100.71±1.63*4.58±0.61*38.56±1.96*

注：*表示P< 0.05，差异显著。

由表2可见，与空白对照组相比，黄芪多糖推荐剂量组和芪参散对照药物组都可以提高斑点叉尾的增重率和特定生长率，其中，推荐剂量组提高斑点叉尾的增重率和特定生长率差异显著。

表2 黄芪多糖对斑点叉尾生长性能的影响Tab.2 Effect of APS on growth performance of I.punctatus

试验地点组别初始尾重/g终末尾重/g增重率/%特定生长率/(%/d)空白对照组25.36±8.9031.45±7.3224.01±0.121.00±0.12仙桃市付光明养殖场对照药物组25.83±8.7833.52±7.6029.77±0.231.18±0.21推荐剂量组24.91±7.9233.95±7.8336.29±0.12*1.41±0.11*空白对照组50.56±11.3856.68±10.6412.10±0.110.55±0.23湖北省宜都市青林寺清江名优鱼专业合作社对照药物组50.12±10.6358.95±9.6117.62±0.360.77±0.14推荐剂量组50.42±10.8060.24±9.8619.47±0.12*0.82±0.13*

注：*表示P< 0.05，差异显著。

从表3可知，在仙桃市付光明养殖场，黄芪多糖推荐剂量组免疫保护率达到88.9%，高于对照药物组；在湖北省宜都市青林寺清江名优鱼专业合作社，黄芪多糖推荐剂量组免疫保护率达到84.2%，也高于对照药物组。结果表明，在饲料中按每日20 mg/kg鱼体重的剂量添加黄芪多糖，可以提高斑点叉尾的免疫力。

表3 黄芪多糖对斑点叉尾的免疫保护率Tab.3 Immune protection rate of APS on I.punctatus

试验地点组别死亡数免疫保护率/%空白对照组18/仙桃市付光明养殖场对照药物组477.8%*推荐剂量组288.9%*空白对照组19/湖北省宜都市青林寺清江名优鱼专业合作社对照药物组573.7%*推荐剂量组384.2%*

注：*表示P< 0.05，差异显著。

2.3 安全性研究

2.3.1 临床观察结果

实验期间，4个组实验鱼均未出现死亡，体格健壮、采食活跃、呼吸正常。鱼体重结果如表4可知推荐剂量组鱼体重增加显著高于其他剂量组和对照组。随着剂量倍数的增加，鱼体重增长趋缓，低于空白对照组。

表4 饲喂黄芪多糖的斑点叉尾体质量Tab.4 Weight of I.punctatus after feeding APS

分组0 d体质量/g21d体质量/g对照组54.67±16.9260.84±13.60推荐剂量54.33±17.6266.01±19.01*3倍剂量55.11±14.2659.21±10.315倍剂量54.36±17.6657.42±12.80

2.3.2 血液生理指标检验结果

由表5可见，与空白对照组相比，在停药后0 d和21 d，推荐剂量组斑点叉尾HGB、WBC、HCT和PLT都有一定增加，但都属于正常范围；3倍推荐剂量组斑点叉尾血液HGB、WBC、HCT和PLT有增有减，差异不显著；5倍推荐剂量组斑点叉尾HGB、WBC、HCT和PLT都有一定减少，但均在正常范围内[16]。

表5 添加黄芪多糖后斑点叉尾血液生理指标变化情况Tab.5 Changes of blood physiological indexes of I.punctatus after adding APS

组别采样时间HGB/(1012/L)WBC/(109/L)HCT/(g/L)PLT/(109/L)空白对照组0 d2.48±0.096223.65±10.74125.18±3.9424.80±5.3821 d2.52±0.17225.84±5.64126.76±3.6524.81±3.18推荐剂量组0 d2.65±0.30230.25±5.56129.68±2.0928.61±2.1021 d2.75±0.11238.81±7.83128.28±2.2230.15±2.063倍剂量组0 d2.35±0.21220.72±5.68114.07±3.7523.86±1.3121 d2.38±0.25224.50±5.80127.07±3.7522.91±1.485倍剂量组0 d2.26±0.08218.35±16.13110.52±2.8121.33±1.2521 d2.24±0.05213.78±18.07107.93±2.9720.38±0.61

2.3.3 血液生化指标检验结果

由表6可见，推荐剂量组和3倍推荐剂量组血清ALT、AST、AKP活性与对照组相比，差异不显著；5倍推荐剂量组血清ALT、AST、AKP 活性在0d和21d都比对照组有一定提高，但差异不显著，表明添加推荐剂量和3倍推荐剂量的黄芪多糖对斑点叉尾肝细胞无影响，而5倍推荐剂量对斑点叉尾肝细胞有一定影响，但不显著。各试验组的ALB、TP、TCH与对照组相比，差异都不显著，表明各添加剂量对斑点叉尾肝功能无明显影响。推荐剂量组和3倍推荐剂量组BUN、CRE与对照组相比，差异不显著；5倍推荐剂量组CRE在0d和21d都比对照组有一定提高，但差异不显著，表明添加推荐剂量和3倍推荐剂量的黄芪多糖对斑点叉尾肾功能无影响，而5倍推荐剂量对斑点叉尾肾功能有一定影响，但不明显。

表6 添加黄芪多糖后斑点叉尾血液生化指标变化情况Tab.6 Changes of blood biochemical indexes of I.punctatus after adding APS

组别采样时间AST/(U/L)ALT/(U/L)AKP/(金氏单位/100mL)BUN/(mmol/L)CRE/(μmol/L)TCH/(mmol/L)ALB/(g/L)TP/(g/L)空白对照组0 d147.00±12.1619.00±0.0029.33±2.080.80±0.1312.00±1.739.35±0.0911.00±0.0029.33±0.5821 d158.67±14.6416.00±1.0042.67±5.861.05±0.0912.33±1.536.08±0.429.00±0.0028.00±2.00推荐剂量组0 d144.35±9.6218.12±2.0529.85±2.310.75±0.1211.63±1.287.35±0.1611.43±0.6829.96±0.8721 d140.67±18.6113.67±0.5845.00±6.080.79±0.05613.67±2.525.89±0.429.00±1.0025.67±0.583倍剂量组0 d149.77±10.0318.95±1.5631.52±1.970.97±0.1112.88±2.548.63±1.5410.38±0.7227.81±1.5721 d169.67±22.9016.33±1.5353.33±2.521.02±0.06413.00±3.608.27±1.369.67±0.5828.00±0.005倍剂量组0 d153.12±11.3420.48±0.8334.26±2.130.88±0.3414.65±1.189.17±2.7110.88±0.9327.13±2.5521 d180.33±22.1417.67±1.5342.86±4.581.06±0.1115.33±2.089.01±2.0410.00±0.0028.00±0.00

2.3.4 剖检和组织病理学检查结果

实验过程中无死亡个体，解剖后未见明显组织形态异常，经制作石蜡切片染色也未发现重要免疫器官头肾及脾脏出现病理变化，如图3所示。

图3 不同剂量的黄芪多糖对斑点叉尾头肾及脾脏的组织病理学影响Fig.3 Histopathological effect on head kidney and spleen of I.punctatus with different doses of APS

3 讨论

目前，关于黄芪多糖对水生动物生长的影响研究较多。向枭等[14]发现黄芪多糖添加水平为0.04%时，齐口裂腹鱼的增重率(WGR)、特定生长率(SGR)、饲料蛋白效率(PER)均达到最大；孙永欣等[17]研究发现黄芪多糖可明显提高刺参特定生长率(SGR)，与对照组相比增加了20.94%；黄玉章等[18]发现各个阶段黄芪多糖添加组奥尼罗非鱼的绝对增重量都比对照组有所提高；杨移斌等[12]也曾研究发现黄芪多糖对中华鳖生长有一定的促进作用。以上研究结果均与本研究中饲喂黄芪多糖可提高斑点叉尾增重率及特定生长率结果一致。究其原因可能因为黄芪多糖中含有较多的活性物质，可在一定程度上促进细胞代谢合成[19]，同时也在一定程度上可加强动物胃液分泌及食物消化，参与机体的物质代谢过程，促进肠道益生菌繁殖，加强消化酶分泌，提高动物营养物质消化及蛋白质合成能力，从而提高动物生长速度[20，21]。

非特异性免疫是机体抗感染的重要屏障，而总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)及白细胞吞噬活性等指标是衡量机体非特异性免疫的重要指标。通过II期及III期临床试验发现，黄芪多糖可明显提高斑点叉尾以上指标，以添加量为20 mg/kg鱼体重最优，故也可提高机体抗细菌感染的能力，这与黄芪多糖可提高杂交鳢抗嗜水气单胞菌感染的能力研究结果一致[12]。以往研究也显示黄芪多糖添加水平为0.04%时，齐口裂腹鱼碱性磷酸酶(ALP)活性最高，酸性磷酸酶(ACP)活性在黄芪多糖添加水平0.06%时最大[14]，在杂交鳢、黄颡鱼及鲤中均得到类似研究结果[12，22，23]。另外，随黄芪多糖添加水平的升高，黄颡鱼吞噬百分比与吞噬指数显著上升(P<0.05)[22]，也与本研究结果一致。曹丽萍等[24]利用qPCR技术检测了黄芪多糖作用于鱼类头肾巨噬细胞后IL-1β的表达情况，发现其明显上调，表明黄芪多糖可诱导IL-1β的表达，增强吞噬细胞的吞噬能力，但黄芪多糖调节鱼类免疫机制还需进一步探讨。

目前关于黄芪多糖对动物安全性研究不多，仅见昭日格图等[25]利用黄芪多糖饲喂大鼠30d，发现5.00、2.50和1.25 g/kg 体重剂量均没有对动物的身体、脏器的生长发育及血液生化指标等产生明显的影响。研究也发现饲喂50 mg/kg鱼体的黄芪多糖，草鱼的血常规指标和血液生化指标与对照组无显著性差异，而且草鱼肝、肾、脾细胞和组织结构上也无异常[26]。本研究也发现每日按20 mg/kg鱼体重投喂黄芪多糖不会对斑点叉尾产生毒性作用，即黄芪多糖安全性较好，具备作为水产免疫增强剂的条件。