温度和孵化方式对大鳍鳠受精卵孵化效果的影响

李晓莉，朱永久，吴兴兵，杨德国，李学梅，朱挺兵

(中国水产科学研究院长江水产研究所，农业农村部淡水生物多样性保护重点实验室，武汉 430223)

大鳍鳠(Mystusmacropterus)属硬骨鱼纲(Osteichthyes)鲇形目(Siluriformes)鲿科(Bagrdae)鳠属(Mystus)，俗称石扁头、石胡子、江鼠等，自然分布于长江和珠江各水系的干流及其支流中，也是鲿科鳠属中一种生长较快、个体较大的经济鱼类，其蛋白质、脂肪、必需氨基酸、鲜味氨基酸含量高，具有较高的食用价值[1]。大鳍鳠曾在长江上游江段渔获物中占有一定比例，产量较大，近年来，由于水利工程的修建、水体污染、过度捕捞等生存压力，大鳍鳠野生资源量迅速下降，捕捞个体呈现出小型化、低龄化等资源衰退现象[2]。上世纪90年代开始，相关单位陆续开展了对大鳍鳠的繁殖生物学、人工繁殖技术的研究，取得了人工繁殖技术的阶段性突破[3-4]，但在人工繁殖过程中，尚存在早期生物学研究基础薄弱、受精卵孵化效果不稳定等问题[5]，制约了大鳍鳠苗种规模化培育，限制了该品种的产业化发展。因此，有效提高受精率和孵化率已成为大鳍鳠人工繁育过程中重要研究内容。

鱼卵受精后，进入胚胎发育阶段，由于行为反应能力有限、对环境应激耐受机制发育不完善等因素，对环境因子变化的感知最为敏感[6-7]。温度是影响鱼类早期生长发育的重要环境因素，在胚胎孵化和代谢调控中起着关键的生理作用，也是影响胚胎成活、影响受精率和孵化率的决定性因素之一[8-9]。近年来，关于水温对早期受精卵发育影响的研究在越来越多的鱼类中得到证实[10]，但温度对大鳍鳠受精卵孵化的影响尚无系统研究。

鱼卵产出后黏性程度因种类的不同有较大差异，按黏性程度分为黏性卵、弱黏性卵和非黏性卵3类[11]。相较于非黏性卵，粘性卵由于自身的黏性特质，如卵膜表层结构遇水反应导致黏性卵在短时间内失去受精能力，受精卵黏连结块致使内部气体交换困难等[12]，进而导致在人工授精和孵化过程中更加困难，产黏性卵的经济鱼类人工授精及孵化方法是生产过程中延续至今的研究课题[13-14]。大鳍鳠受精卵为弱粘性[15]，目前生产上主要采用挂网孵化法，但由于水质管理困难，受精卵易滋生水霉，导致孵化效果不稳定，因此探索大鳍鳠受精卵适宜的孵化方式是大鳍鳠人工繁育过程中重要研究内容。

为此，本实验采用单因子设计实验开展了不同温度(22、24、26、28和30 ℃)和不同孵化方式[脱黏孵化(蛋白酶脱黏、滑石粉脱黏)、挂网孵化、孵化框孵化]对大鳍鳠受精卵孵化的影响进行研究，旨在筛选出适宜的大鳍鳠孵化温度和孵化方式，为大鳍鳠规模化高效制种提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 孵化条件

实验于2022年6月在中国水产科学研究院长江水产研究所特有鱼类繁育基地内进行，孵化用水为工厂化循环水，养殖水体pH为8.4±0.1，溶解氧为(7.5±0.3)mg/L，日换水率为50%，除温度组实验外，水温稳定在(27±1)℃。

1.2 人工受精

1.2.1 亲鱼的选择

实验用大鳍鳠亲鱼来自中国水产科学研究院长江水产研究所特有鱼类繁育基地，亲鱼均为4龄以上、体质健壮、无伤无病，性腺发育情况良好。雄鱼规格为(409.16±87.09)g，雌鱼规格为(310.51±100.63)g。

1.2.2 卵子采集

亲鱼捕捞后雌雄分开暂养。在人工受精前采用二次注射法用催产剂(HCG、LHRH-A和DOM混合药物)对雌鱼进行腹腔注射诱导催熟产卵，及时检查卵子成熟情况，用手触摸雌鱼腹部有卵粒流动，轻挤雌鱼腹部有少量卵粒流出时，便开始进行人工授精。将卵子挤入事先准备好的干净且干燥的盆中并称重，避免鱼卵与水接触。为减少卵发育程度差异对受精率统计的影响，参照CHATAKONDING等[16]的方法进行评估，卵液pH>7.4即可以判断卵子质量合格。

1.2.3 精液采集

受精前12 h对雄鱼进行催熟，催熟药物及剂量同雌鱼一致。雄鱼精液收集采用杀鱼取精的方法。取出精巢后用滤纸吸干精巢表面组织液和血液，称重，在干净的小烧杯中剪碎，用纱布过滤。为减少个体精子质量差异对受精率的影响，实验采用多尾雄鱼的精子混合样本。将采集的精液按照1∶10加入精子稀释液[22]，混合均匀放置于碎冰上保存备用。

1.2.4 人工授精

实验过程采用半干法授精：将混合鱼卵称重后，每200 g卵子加入10 mL稀释后的精液，用干燥羽毛轻轻搅拌10 s，然后加入激活液[17]再搅拌2 min使卵受精。倒出多余的激活液和卵巢液后再用清水冲洗受精卵1～2遍，完成受精。

1.3 孵化方法

1.3.1 不同温度对大鳍鳠孵化及仔鱼成活的影响

条件设置：实验设置5个温度组，分别是22、24、26、28和30 ℃，每个温度组设3个平行。实验在5个独立控温的室内循环水养殖系统中进行，系统由养殖桶、温度调控器、冷凝机、电加热板等控温装置(控温误差±0.5 ℃)及水处理装置构成。养殖桶直径为100 cm，高度为80 cm，每个养殖桶内放置3个直径为20 cm镂空带滤网的圆形盛卵框，养殖桶一侧有冲水装置持续充水，防止卵粘连成块滋生水霉，养殖系统水流量为6.7 L/min，每日监测温度、溶解氧[(7.5±0.3)mg/L]、pH(8.4±0.1)、氨[(0.060±0.025)mg/L]和亚硝酸盐[(0.032±0.008)mg/L]水平。光周期为12∶12，白天光照度约为1 000 lx。

孵化方法：将受精卵倒入盛卵框中，每框放100颗卵开始孵化。受精卵孵化至原肠晚期时，通过颜色发白、不透明的特征肉眼辨认未受精的卵，并及时剔除，避免受精卵被真菌和细菌感染。统计24 h、48 h好卵率，鱼苗出膜后计数出膜仔鱼数，出膜后24 h、96 h计算成活率。

计算公式如下：

好卵率=(好卵数/初始卵总数)×100%

出膜率=(出膜仔鱼数/初始卵总数)×100%

成活率=(出膜仔鱼数/初始活苗总数)×100%

孵化时间：50%受精卵孵化出膜时所用的时间。

1.3.2 不同孵化方式对大鳍鳠受精卵孵化的影响

实验设挂网孵化、孵化框孵化、蛋白酶脱黏孵化、滑石粉脱黏孵化四组孵化方法，每组设3个平行。

挂网孵化法：实验在直径300 cm、高110 cm，水深100 cm的孵化桶中进行。挂网用聚乙烯网片为30目，规格为60 cm×40 cm。将300颗受精卵均匀撒在网片上，晾干10 min，待受精卵充分粘贴在网片上后，挂入孵化桶中流水孵化。

孵化框孵化法：实验在直径300 cm的孵化池进行，将底部有滤网的孵化框放入孵化池内，在孵化框上下同时以不同的角度注水，使孵化框中的受精卵定时均匀翻动，不形成死角，定时剔除浮于水体表层的坏卵。将300颗受精卵直接倒入孵化框内，定时剔除浮于水体表层的坏卵。

滑石粉脱黏孵化：滑石粉脱黏孵化与蛋白酶脱黏孵化均在直径60 cm，高80 cm，锥底高50 cm的孵化桶中进行，水流从下部流入，流量为2.63 L/s，将鱼卵冲散，不致粘连。称取200 g滑石粉倒入10 L孵化用水中，充分搅拌均匀，按照100 mL脱黏剂∶100 g受精卵的比例将脱黏剂倒入300颗受精卵中，轻轻搅拌30 s，重复3次后倒出多余液体，再用清水冲洗2次后将受精卵倒入孵化桶中孵化。

蛋白酶脱黏孵化：称取30 g碱性蛋白酶(活性200 U/g)倒入10 L孵化用水中，充分搅拌均匀后备用，大鳍鳠卵子受精后按照100 mL脱黏剂 ∶100 g受精卵的比例倒入300颗受精卵中，轻轻搅拌2 min倒出多余液体，后用清水冲洗2次，将受精卵倒入孵化桶中孵化。为进一步比较不同蛋白酶浓度的脱黏孵化效果，开展了3、1.5和0.75 g/L三个不同浓度的比较实验，方法同上。

各组实验均重复3次，各实验组统计好卵率、出膜率指标，计算公式同1.3.1。

1.4 数据统计分析

实验数据用“平均数±标准差(X±SD)”表示。使用Excel 2019和SPSS 24.0软件对数据进行统计分析，用方差分析(ANOVA)检验显著性差异。

2 结果

2.1 不同温度对大鳍鳠受精卵孵化及仔鱼成活的影响

从图1中可以看出，22～30 ℃时，24 h好卵率随着温度的上升呈线性下降趋势，变化范围为31.44%～64.63%，线性方程为y=-4.154 8x+158.11(R2=0.837 7)。其中低温组(22 ℃)、中温组(24、26 ℃)和高温组(28、30 ℃)之间有显著性差异。48 h好卵率随温度升高呈先升高后降低的趋势，22 ℃最低，仅为1.76%，28 ℃最高，为27%，各个温度组之间差异显著。采用曲线回归分析温度与48 h好卵率的关系，其中二项式函数拟合效果最好，其方程为：y=-1.404 9x2+75.155x-974.03(R2=0.799 5)，拟合得到温度为26.8 ℃时48 h好卵率最大。

图1 温度对大鳍鳠好卵率的影响(Ⅰ)及温度与好卵率的关系(Ⅱ)Fig.1 Effect of temperature on the good egg rate (Ⅰ)and the relationship between temperature and good egg rate (Ⅱ)of M.macropterus

从图2中看出，温度对大鳍鳠仔鱼出膜率影响显著：出膜率随着温度的升高呈先升高后降低的趋势。22 ℃时大鳍鳠仔鱼出膜率为0，其他温度组表现为30 ℃组(11.89%)<24 ℃组(17.95%)<26 ℃组(25.33%)<28 ℃组(30.57%)，24 ℃和30 ℃组显著低于26 ℃和28 ℃组。利用二次方程对大鳍鳠出膜率进行拟合分析，得到拟合方程为：y=-1.354 2x2+72.217x-933.77(R2=0.792 5)，通过求导推算极值的方法，得出大鳍鳠受精卵的最适发育温度为26.8 ℃。此外，实验结果还表现为仔鱼出膜时间随温度的上升而逐渐缩短，30 ℃组出膜时间最短(46 h)；其次为28 ℃组(58 h)，再次为26 ℃组(79 h)，24 ℃组出膜时间最长(88 h)。

图2 温度对大鳍鳠出膜率的影响(Ⅰ)及温度与出膜率的关系(Ⅱ)Fig.2 Effect of temperature on the hatching rate (Ⅰ)and the relationship between temperature and hatching rate (Ⅱ)of M.macropterus

大鳍鳠仔鱼出膜后的24 h成活率如图3所示，24 ℃组(54.76%)显著低于26 ℃组(95.45%)、28 ℃组(91.67%)和30 ℃组(92.59%)，后三者则差异不显著。24 h后，24～28 ℃条件下，仔鱼成活率较稳定，96 h与24 h成活率差异不显著，分别为52.38%、90.91%和92.59%，而30 ℃组则显著降低，为40.74%。

图3 温度对大鳍鳠仔鱼成活率的影响Fig.3 Effect of temperature on the survival rate of M.macropterus larva

2.2 不同孵化方式对大鳍鳠受精卵孵化的影响

4种孵化方式进行对比实验，结果如图4所示。从图中可以看出，挂网组大鳍鳠24 h好卵率最高(48.11%)，其次是孵化框组(45.05%)，再次是蛋白酶脱黏(19.98%)，滑石粉脱黏孵化组最低(15.32%)，前二个实验组与后二个实验组之间差异显著。出膜率结果表现为，挂网组(16.07%)>蛋白酶脱黏组(12.08%)>孵化框组(9.61)%>滑石粉脱黏组(9.26%)。为探究卵膜对孵化过程的影响，实验分析了出膜率/24h好卵率，结果显示，脱黏组的比值最大，均为60.46%，显著高于挂网组(33.40%)和孵化框组(21.32%)，说明卵膜的存在对出膜率影响显著。

图4 孵化方式对大鳍鳠受精卵孵化的影响(Ⅰ、Ⅱ)Fig.4 Effects of hatching methods on hatching of M.macropterus embryos(Ⅰ、Ⅱ)

2.3 蛋白酶浓度对大鳍鳠受精卵孵化的影响

在实验设置的3个蛋白酶浓度梯度下，大鳍鳠孵化效率如图5所示，24 h和48 h好卵率均表现为0.75 g/L组(25.03%、16.80%)显著高于3 g/L组(19.98%、15.42%)和1.5 g/L组(18.16%、12.03%)，后两者之间差异不显著，说明脱黏强度对胚胎发育有显著影响。出膜率则表现为随浓度降低而显著降低的趋势，分别为12.08%(3 g/L组)、7.90%(1.5 g/L组)和2.87%(0.75 g/L组)，出膜率/24h好卵率的比值表现为3 g/L组(60.46%)>1.5 g/L组(43.50%)>0.75 g/L组(11.47%)，三者之间差异显著，说明卵膜的存在对出膜过程造成了影响，导致出膜率降低。

图5 蛋白酶浓度对大鳍鳠受精卵孵化的影响Fig.5 Effect of protease concentration on hatching of M.macropterus embryos

3 讨论

在鱼类胚胎发育过程中，温度通过调控孵化酶的作用影响鱼类胚胎孵化，温度过高会抑制孵化酶活性或使得卵裂及器官分化过程出现紊乱[18]，从而导致胚胎孵化率下降和畸形率升高，低温同样会抑制胚胎内孵化酶的活力，降低胚胎细胞代谢和分裂速度，进而减缓或阻止发育进程[19]，只有在适宜的温度范围内孵化酶拥有最大活性[20]。在本研究设置的温度范围内，48 h好卵率、出膜率及成活率随着温度的升高呈先升高后降低的趋势，温度低于22 ℃大鳍鳠无法出膜，温度过高则出膜率降低，畸形率升高。与马本贺等[18]、李文豪等[19]的研究结果一致。二项式拟合得到大鳍鳠最适孵化温度为26.8 ℃，这与乌苏里拟鲿(Pseudobagrasussuriensis)(26 ℃)[21]、瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrusvachelli)(24～27 ℃)[22]、斑鳠(Mystusguttatus)(26～28 ℃)[23]等鲇形目鲿科鱼类的孵化温度基本一致。实验中26 ℃和28 ℃组大鳍鳠出膜后仔鱼的成活率显著高于其他温度组，进一步证明了大鳍鳠适宜的胚胎发育温度为26～28 ℃。有资料报道大鳍鳠在水温为22～30 ℃的天然河流均能自然繁殖[24]，本实验中22 ℃条件下大鳍鳠无法出膜，这一方面可能与胚胎不同发育阶段对温度的敏感程度不同有关，于欢欢等[25]研究发现原肠中期可能是石斑鱼杂交子代胚胎发育过程中一个受温度影响的重要敏感期。本实验在恒温条件下进行，使22 ℃组大鳍鳠胚胎发育在温度敏感发育期终止，自然繁殖是在变温环境中发生，温度并非一直保持在22 ℃，胚胎发育敏感期可能被避开了；另一方面野外环境中胚胎发育受多个生态因子的共同作用[26]，导致与本实验结果有差异。本研究中，随着温度的升高，大鳍鳠孵化时长从88 h缩短到46 h，这和马跃岗等[4]的报道基本一致，这是由于在适当的温度范围内，温度提高可以提高孵化酶活性，加快胚胎发育速度，从而缩短孵化时间[20]，故在不影响孵化率的情况下，可适当提高孵化温度，缩短孵化时间，以降低遭受霉菌感染或其他生物侵袭的风险，进一步提高孵化率。

目前黏性卵孵化主要有脱黏孵化法和人工鱼巢接卵孵化法[12]，本研究中挂网组(接卵孵化)和水流孵化框组(不脱黏孵化)24 h好卵率显著高于脱黏组，这与卵膜的保护作用有关，卵膜可作为受精卵内部与外部环境污染物间隔离的屏障，可以保护鱼卵免受环境变化(如干燥、机械力)影响造成的器质性损伤以及水流、捕食者和病原体(如细菌和真菌)感染，并且可以促进发育中胚胎气体交换[27-29]。在脱黏过程中，不可避免地会对卵膜造成损伤，影响卵膜的保护作用，进一步影响脱黏组的好卵率。有研究表明，鱼类的孵化受孵化酶、胚体运动等因素的影响，鱼类受精后形成的卵壳会在胚胎发育的晚期阻碍胚体的出膜[30]，本研究中不同实验组大鳍鳠仔鱼出膜率表现为挂网组>蛋白酶组>孵化框组>滑石粉组，表明四个实验组之间的差异相比24 h好卵率的差异显著缩小，另外，从不同孵化方式出膜率/24 h好卵率来看，脱黏孵化的比值显著高于挂网组和孵化框组，同时，不同蛋白酶浓度实验结果也表现为出膜率随浓度降低而显著降低的趋势，以上实验结果均表明卵膜的存在对出膜过程造成了影响，导致出膜率降低。这与上述报道一致。

本实验结果显示挂网孵化组出膜率较高，但挂网法易遭受水霉感染，本研究在2022年度的催产过程中，挂网孵化5批次，有3批次因为受精卵滋生水霉而孵化失败，综合考虑采取蛋白酶脱黏孵化的方法较好。因此，在后续的大鳍鳠孵化研究中将重点考虑脱黏孵化方式，同时，脱黏使用剂量和处理时间对其孵化成功至关重要，做到既不伤害受精卵，又要能够减少卵膜对仔鱼出膜的影响。另外，需要加强大鳍鳠受精卵表面黏性成分的研究，以便于有针对性地使用蛋白酶分解的方法，对鱼卵进行高效的脱黏处理，提高大鳍鳠胚胎孵化效率。