基于OPG/RANKL及Notch1信号通路探讨温针灸对膝骨性关节炎兔软骨下骨损伤的影响

冯伦冬,黄 卫,李厚臣,杨晓倩

1.海口市第三人民医院,海南 海口 571100;2.海南省中医院,海南 海口 570100

膝骨性关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一种以关节软骨退化为特征的关节疾病,主要表现为关节疼痛、畸形和功能障碍,甚至残疾[1]。尽管KOA的发病机制仍存在争议,但信号通路转导异常及软骨退化和软骨下骨损伤在KOA发生发展中发挥重要的作用[2-3]。有临床研究报道,抑制软骨下骨损伤可以有效缓解软骨侵蚀,提示抑制软骨下骨吸收是用于治疗KOA的潜在目标[4]。骨保护蛋白(Osteoprotegerin,OPG)及核因子κB受体活化子配体(Receptor activator of NFKB ligand,RANKL)是调节骨重塑的关键通路之一,主要通过调节破骨细胞活性来实现。OPG及RANKL在软骨下骨中的表达对骨重塑过程产生极大影响,可能在KOA发病过程中起着重要的作用[5]。Notch是一种存在于多种动物体内的进化高度保守的信号通路,与靶基因Notch1的结合在骨性关节炎软骨细胞增殖、分化、凋亡以及维持软骨细胞基质代谢平衡等方面具有重要作用[6]。温针灸是治疗KOA的常用中医方法之一,能促进软骨的代谢水平和炎性物质的吸收,抑制其氧化应激损伤,从而减轻关节软骨病变和改善关节活动障碍[7]。然而,关于温针灸对KOA兔软骨下骨形态改变及其与OPG/RANKL及Notch1信号通路的调节作用仍未完全阐明。为此,本研究通过建立兔KOA模型,观察温针灸对OPG、RANKL及Notch1表达的影响,探讨温针灸通过调控OPG/RANKL及Notch1信号通路在 KOA中的作用机制,以期为温针灸治疗KOA提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取普通级健康新西兰兔50只(雌雄各半),6个月,体质量约2.5～3.0 kg,由北京动物实验中心提供,动物许可证:SYYX2020-0005。在单独的笼子中饲养,温度和湿度分别保持在(22±2)℃和50%～60%,标准饲料。兔子适应1周后,随机分为空白组(12只)和造模组(38只)。严格按照《实验动物管理条例》进行实验过程,本研究经本院伦理委员会批准。

1.1.2 试剂与仪器 DAB显色剂、10%山羊血清及二抗(北京中杉金桥);抗OPG、抗RANKL、抗Notch1及抗β-actin(北京博奥森);BCA试剂盒(北京索莱宝);反转录及荧光定量PCR试剂(广州锐博生物)。PCR仪(美国ABI 7500型);酶标仪、电泳仪及扫描仪(美国Bio-Rad);石蜡切片机(德国Leica);普通光学显微镜及图像分析系统(日本Olympus);针灸针(0.35 mm×40 mm,苏州医疗用品公司);艾条(直径1.9～2.1 cm,长20～21 cm,江苏康美制药公司)。

1.2 造模方法及分组

兔KOA模型采用管型石膏伸直位固定法,将造模组兔右后肢膝关节伸直,剃去兔毛,固定右后肢(石膏绷带包绕于踝关节上2 cm处),打紧医用绷带,待石膏硬化后放回兔笼,固定6周制备KOA模型。固定结束后随机取出空白组和造模组各2只兔,空气栓塞处死,对兔右膝关节软骨下骨进行HE染色,观察软骨结构。以造模组软骨下骨细胞排列紊乱变薄,潮线欠佳和有血管穿过为造模成功。最后拆除石膏,将36只造模成功兔随机分为模型组、药物组和温针灸组,每组12只。

1.3 干预方法

1.3.1 空白组 不予任何干预。

1.3.2 模型组 每天在兔架上固定于15 min,共4周。

1.3.3 药物组 给予150 μg/kg阿仑膦酸钠溶液(杭州默沙东制药有限公司,国药准字J20130085)灌胃,1次/d,共4周。

1.3.4 温针灸组 参考《实验针灸学》取穴,给予兔右后肢“鹤顶”“内膝眼”及“外膝眼”温针灸治疗[8],直刺进针3～5 mm,艾炷固定于针灸针末端,近端点燃,灸3壮艾炷(约15 min),1次/d,共4周。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 兔Lequesne MG评分 在干预结束后次日,应用Lequesne MG评分量表对各组兔右膝关节功能障碍程度进行评估,总分越高代表膝关节病变越严重。评分方法见表1。

表1 Lequesne MG评分量表标准

1.4.2 标本收集 干预结束后,空气栓塞处死各实验兔,碘伏消毒,取右后肢膝关节端股骨软骨下骨组织,使用生理盐水冲洗,放入4%多聚甲醛溶液固定保存,后期进行脱钙和石蜡包埋切片,用于后续实验检测。

1.4.3 HE染色观察形态学 对石蜡切片进行脱蜡,然后行苏木素染色、1%盐酸酒精分化、伊红染色、脱水、透明及封片。观察软骨下骨组织形态学变化,并进行Mankin评分。见表2。

表2 Mankin评分标准

1.4.4 OPG、RANKL及Notch1 mRNA含量检测 采用Trizol法提取软骨下骨组织中的mRNA含量,以提取的RNA为模板,逆转录cDNA。应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测mRNA含量。反应体系:正反向引物各0.5 μL,cDNA模板1 μL,双蒸水8 μL,TaqMan通用混合物溶液10 μL。扩增条件为:95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s,共40个循环。以β-actin为内参,采用2-△△Ct法计算OPG、RANKL及Notch1 mRNA含量。

1.4.5 蛋白质印迹法检测OPG、RANKL及Notch1蛋白表达 提取兔软骨下骨组织的蛋白质,采用BCA试剂检测蛋白的浓度。进行电泳分离、转膜,脱脂乳封闭,分别加入抗OPG、抗RANKL、抗Notch1和抗β-actin(内参)在4 ℃孵育过夜,洗涤滤膜后在二抗中孵育1 h,采用增强化学发光试剂检测各蛋白表达情况。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组兔膝关节软骨下骨组织形态变化

空白组软骨下骨细胞排列整齐均匀,潮线完整,软骨层结构清晰完整,细胞形态正常,细胞基质着色正常;模型组软骨结构破损,软骨层变薄,软骨下骨细胞排列紊乱,细胞固缩坏死,细胞空泡多,细胞基质染色显著减少;药物组和温针灸组软骨表面相对光滑完整,结构较为清晰,软骨下骨处细胞分布较为整齐均匀。

2.2 各组兔Lequesne MG评分及Mankin评分比较

模型组、药物组和温针灸组Lequesne MG评分及Mankin评分明显高于空白组,差异具有统计学意义(P<0.01),药物组和温针灸组Lequesne MG评分及Mankin评分明显低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.01),且温针灸组Lequesne MG评分及Mankin评分明显低于药物组,差异均有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 各组兔Lequesne MG评分及Mankin评分比较

2.3 各组兔OPG、RANKL及Notch1 mRNA含量比较

与空白组比较,模型组、药物组和温针灸组OPG mRNA表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01),模型组RANKL及Notch1 mRNA表达水平均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,药物组和温针灸组OPG mRNA表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01),RANKL及Notch1 mRNA表达水平均明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01),OPG/RANKL及OPG/Notch1比值明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。温针灸组与药物组OPG、RANKL及Notch1 mRNA含量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表4和图1。

图1 OPG、RANKL及Notch1 mRNA溶解曲线图

表4 各组兔OPG、RANKL及Notch1 mRNA含量比较

2.4 各组兔OPG、RANKL及Notch1蛋白表达比较

与空白组比较,模型组RANKL及Notch1蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01),OPG/RANKL及OPG/Notch1比值明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,药物组和温针灸组OPG蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01),RANKL及Notch1蛋白表达水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01),OPG/RANKL及OPG/Notch1比值明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。温针灸组OPG蛋白、OPG/RANKL及OPG/Notch1水平高于药物组,差异有统计学意义(P<0.01)。见表5和图2。

图2 各组兔OPG、RANKL及Notch1蛋白表达水平

表5 各组兔OPG、RANKL及Notch1蛋白表达比较

3 讨论

KOA是一种病因复杂的异质性疾病,其中关节软骨下骨出现损伤和软骨下骨细胞凋亡在KOA的发病中起着重要作用。当机体发生KOA病变时,软骨下破骨细胞异常激活,造成骨吸收与骨形成平衡被打破,从而导致骨重塑异常[9]。OPG是RANKL的诱骗受体,能阻止RANKL与其受体的结合,抑制破骨细胞的增殖、分化和成熟并诱导其凋亡,从而抑制骨骼吸收[10]。Kovács等[11]研究指出,OPG作为重要的骨保护因子,与RANKL竞争性结合调控骨代谢信号通路,使得成骨细胞活性增强和骨保护增强。RANKL是调节破骨细胞分化发生的重要分子,能加速破骨细胞前体分化并促进破骨细胞成熟,从而发挥促进骨吸收作用。有研究证实,OPG/RANKL信号通路是重要的破骨细胞调控系统,维持正常骨重塑和骨量稳定性,可通过调节OPG/RANKL信号通路有效抑制破骨细胞的形成和骨吸收,参与KOA的病理过程[12]。Notch1作为Notch家族的主要成员之一,参与调控软骨细胞分化、增殖及程序性死亡等过程,抑制Notch1信号通路对减轻骨关节炎具有重要帮助[13]。越来越多的研究表明,KOA的发生发展与多个信号传导途径有关,其中OPG/RANKL及Notch1信号对软骨基质的合成代谢和分解代谢都起着重要作用[14-15]。温针灸是一种针刺与艾灸相结合的技术,可通过抑制软骨细胞凋亡和软骨基质的水解从而起到治疗KOA的效果[16]。KOA在中医学归为“骨痹”,温针灸借助艾灸的热力及药力刺激经络、腧穴,起到行气活血、袪风除湿功效,能够有效治疗此类痹证。本研究选取鹤顶”“内膝眼”“外膝眼”进行治疗,为患处局部取穴,“腧穴所在,主治所及”,以疏通局部气血,恢复膝关节软骨内环境平衡。

本研究行温针灸治疗后,软骨表面光滑结构清晰,软骨下骨处细胞分布整齐均匀,可明显降低Lequesne MG评分及Mankin评分,改善KOA兔膝关节肿胀、跛行等行为和减轻软骨下骨的损伤。这可能与温针灸促进膝周的血液循环有关。张艳玲等[17]研究也发现,温针灸治疗能够显著改善KOA兔关节软骨结构,减轻软骨缺损和基质降解,发挥治疗KOA的作用。

OPG、RANKL及Notch1是影响骨质量的主要因子,通过OPG/RANKL及OPG/Notch1比值可反映骨代谢和骨质破坏情况,当其失衡时,能诱导骨再吸收,破坏骨环境稳定,进而引发骨代谢病。本研究表明,温针灸可促进OPG升高和抑制RANKL及Notch1的表达,通过上调OPG/RANKL及OPG/Notch1比值,减少软骨下骨吸收,抑制软骨下骨恶化,改善骨微环境,进而减轻了KOA兔软骨下骨的损伤,具有延缓KOA进程的作用。一方面OPG可阻止RANKL与其受体的结合,抑制破骨细胞的分化,阻止骨吸收,从而达到减缓软骨退变的作用[18];另一方面Notch1对维持软骨基质代谢平衡起着十分重要作用,抑制Notch1信号通路后,关节软骨破坏减少,骨关节炎减轻,对延缓KOA进展起着关键作用。因此,调控OPG/RANKL及Notch1信号通路的表达是减缓KOA进展的治疗靶点。武永利等[19]研究认为,温针灸可通过调控OPG/RANKL信号通路来减缓软骨下骨破坏,从而发挥治疗KOA的目的。另有研究表明,Notch1信号通路通过凋亡途径抑制软骨细胞凋亡,减轻KOA发展,为治疗KOA提供帮助[20]。

综上所述,温针灸可促进OPG表达,抑制RANKL及Notch1表达,通过调控OPG/RANKL及Notch1信号通路,减轻KOA兔软骨下骨的损伤,从而起到治疗KOA的作用。但影响KOA的发病因素较多,本研究仅观察了温针灸对OPG/RANKL及Notch1信号通路的调控,未能深入分析OPG/RANKL与Notch1在KOA中的关系及相互作用机制,今后仍需要进一步深入研究。