表观遗传机制在原发性高血压中的作用及针刺干预研究

董新蕾,燕虹宇,史维霞,闫钦风,汶 健,张丽丽,3△

1.天津中医药大学第一附属医院,天津 300193;2.国家中医针灸临床医学研究中心,天津 300381;3.天津市针灸学重点实验室,天津 300073

高血压是心血管疾病(CVD)、慢性肾病(CKD)和认知障碍最常见的可预防性危险因素,也是世界范围内致死和致残的主要因素,可分为由环境和遗传因素综合造成的原发性高血压(EH)以及其他疾病导致的继发性高血压[1]。中国高血压调查最新数据表明, 2012年—2015年间,我国成年人口高血压发生率大约为27.9% ,且总体呈升高趋势[2]。而针刺作为中医学的重要组成部分,可分别从免疫、内分泌、氧化应激和神经机制等多靶点、多途径达到降压目的[3],但目前针刺降压有关基因和蛋白层面的研究仍相对较少[4]。

C.H.Waddington首次定义表观遗传学是研究基因型在生物体生长过程中形成表型的机理即核苷酸序列不发生改变,而基因转录翻译的过程发生可遗传性变化[5]。提示在基因组中,除了改变核苷酸序列,还可以通过修饰基因、DNA与蛋白质相互作用等多途径、多层次的调节遗传基因。另外,表观遗传标志物的分布和表达都易受环境干扰,即强调基因与环境的相互作用且存在可逆性。以上特点与针刺作用的综合性、功能性、整体性和双向性有很高的契合度[6]。

研究表明代谢性疾病、神经系统疾病、炎症和癌症等人类疾病的发生和发展过程均与异常的表观遗传修饰息息相关,而中医针刺作为环境因素可以通过影响表观遗传的基因表达进而产生改善疾病的功效[7]。另外,以表观遗传学相关蛋白酶表达水平或者表观遗传修饰水平为靶标,可以使针刺疗法更具有针对性地干预疾病。因此,笔者认为将表观遗传修饰引入针刺治疗EH机制研究中具有重要意义。

1 原发性高血压的表观遗传机制

经典表观遗传学包括:组蛋白修饰、DNA甲基化、染色质重塑以及非编码RNA等;而最近兴起的RNA表观遗传修饰是mRNA上最普遍、最丰富的RNA修饰,其中N6-甲基化腺嘌呤(m6A)为重要标志[8]。该段将从DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA以及RNA甲基化(主要是m6A)4个方面总结EH的表观遗传机制。

1.1 DNA甲基化与原发性高血压

DNA甲基化是指通过调节转录因子与DNA的结合或利用调节基因的蛋白质使基因表达与沉默的过程, CpG 岛之前的胞嘧啶或鸟嘌呤核苷酸是关键位点[9]。DNA甲基化主要通过体液调节因素、体液平衡因素、内皮因素和炎性因子因素等影响血压变化[10]。

1.1.1 体液调节因素 由肾素、血管紧张素(Ang)等多种激素及蛋白酶构成的肾素血管紧张素系统(RAS),对机体血压的调控发挥重要作用。AngII受体(AT1R和AT2R)可与AngII结合后通过多种机制升高血压,同时AT1R(AT1aR和AT1bR)可促进 AngII发挥大部分生物学作用[11]。Pei 发现年龄和血压都影响AT1aR启动子区域CpG甲基化,且该甲基化程度与AT1aR有关,是高血压发展的原因[12]。血管紧张素转换酶2(ACE2)可通过降解AngⅡ并生成血管扩张剂Ang 1-7来促进血管扩张, Fan 等发现EH患者外周血组织中ACE2基因的CpG4和CpG5甲基化频率均高于健康组,且确定CpG5甲基化为EH的重要预测因素,提示ACE2启动子甲基化与原发性高血压具有相关性[13];大脑中的RAS 在高血压发病机制中具有因果作用,孕期母体蛋白质缺乏可通过RAS的变化导致成年后代高血压,且研究证实急慢性脑室内注射ACE抑制剂可减缓高血压发展。Goyal在孕期母体低蛋白饮食小鼠胎儿大脑中发现ACE1 mRNA显著增加,提示与ACE-1基因启动子区域甲基化显著缺失有关[14]。

1.1.2 体液平衡因素 水和无机盐代谢失衡在原发性高血压发病中具有重要的作用。Na(+)-K(+)-2Cl(-)共转运蛋白 1(NKCC1)是与高血压发生有关的转运蛋白,研究表明使用NKCC1抑制剂可降低血压,若同时敲除NKCC1基因,则血压不发生改变。Lee发现NKCC1基因的50个非翻译区和相邻的内含子都含有较多CpG岛,后采用亚硫酸氢盐限制性试验和亚硫酸氢盐测序联合法观察到NKCC1启动子在SHR主动脉和心脏中的低甲基化,提示导致SHR高血压的NKCC1表达上调与其启动子的低甲基化状态有关,同时考虑SHR与健康大鼠对NKCC1特异性抑制剂敏感度不同也是由NKCC1启动子甲基化程度不同所引起[15]。

1.1.3 内皮因素 Mfn2基因在高血压患者的VSMC中以低水平表达,是一种负调节血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的基因。研究发现,高血压患者的Mfn2基因内含子C碱基甲基化水平明显低于正常血压组,提示低甲基化抑制该基因表达导致血压升高[16]。

1.1.4 炎性因子因素 研究表明,TLR2(Toll样受体2)、iNOS(诱导型一氧化氮合酶)和IFN-γ(干扰素-γ)均在炎症性心血管疾病中发挥重要作用。 Alexeeff发现DBP(舒张压)与TLR2和iNOS基因高甲基化有正比关系,而DBP和SBP(收缩压)却均与IFN-γ基因低甲基化成正比[17],以上提示促炎基因甲基化与血压变化的相关性。

1.2 组蛋白修饰与原发性高血压

组蛋白是染色质中与基因紧密结合的氨基酸, 调控转录过程并在细胞增殖期间发挥维持必要的染色质状态的作用,且参与到调节基因表达、染色质状态和复制与修复DNA的过程。其修饰种类主要包括:甲基化、乙酰化、SUMO化、泛素化和磷酸化等[18]。

现代已有研究表明组蛋白甲基化、乙酰化和SUMO化等均在高血压的发生发展中起重要作用[10]。基因表达的激活和沉默与组蛋白甲基化有密切联系[19]:因高血压易引起靶器官损伤如心肌肥厚,其中,心房利尿肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)在肥厚心肌中被激活,组蛋白H3的第4位赖氨酸残基三甲基化(H3K4me3)能促进基因的转录翻译过程,而H3K27me3与H3K9me3却产生抑制作用。Mehrotra研究发现盐敏感大鼠心脏中ANP、BNP基因启动子上的H3K4me3水平显著高于抗盐大鼠,而抗盐大鼠心脏的H3K27me3和H3K9me3水平显著低于盐敏感大鼠[20]。组蛋白乙酰化可调节基因表达的动态平衡,其中组蛋白乙酰转移酶(HAT)和去乙酰化酶(HDAC)起到关键作用。 NLRP3炎症小体是VSMC表型转化和增殖的关键调控因子,VSMC增殖与血管重塑均参与到高血压的发生发展。Sun发现高血压中组蛋白乙酰有助于活化SHR中VSMC的NFκB(核转录因子)进而激活NLRP3炎症小体,而抑制HAT则减弱SHR中血管平滑肌增殖以及血管重塑[21]。NO是血管内皮舒张因子,通过影响血管内皮功能参与高血压的发生发展[22],Zhang发现SUMO化抑制剂和SUMO1(小泛素样修饰剂1)可改善 AngⅡ诱导的高血压小鼠主动脉的血管扩张,可能是由于SUMO化抑制剂增加了eNOS(内皮型一氧化氮合酶)表达和NO(一氧化氮)的产生[23],提示组蛋白SUMO化是调节血管功能的关键修饰且与高血压存在相关性。

1.3 非编码RNA与原发性高血压

非编码RNA(ncRNA)是不参与翻译的RNA分子,根据核苷酸大小被分为小ncRNA(sRNA,<200nt,如miRNA)和长ncRNA(lncRNA,>200nt,如lincRNA、circRNA)[24]。近年来,有关于非编码RNA对高血压病理生理学作用的研究与日俱增。

1.3.1 miRNA 高血压靶器官损伤的基础是血管加速老化,氧化应激增加、周围炎症增加和内皮功能障碍等都将加重由血管周围纤维化介导的血管僵硬程度。Nosalski发现miR-214可通过阻止T细胞活化和IFN-γ释放来保护小鼠内皮功能,防止高血压引起的血管僵硬和血管周围纤维化[25]。Cheng发现miR-204-5p可以通过靶向SHP2(蛋白酪氨酸磷酸酶)和抑制STAT3(转录活化蛋白3)的活化来保护高血压肾损伤患者免受肾脏纤维化损伤[26];miRNA 4516的上调和miRNA 145的下调可以作为高血压的独立预测因子[27]。以上表明miRNA的调节可能能够介导病理性血管损伤、重塑和血管生成的进展,这对高血压疾病具有重要意义。

1.3.2 lncRNA Chen S等[28]通过RCT研究发现低表达水平的NR-034083和高表达水平的NR-104181是高血压的危险因素。内皮祖细胞(EPC)在内源性血管修复中起重要作用,促进生成新血管并修复损伤内皮,与高血压联系密切。Li C[29]发现lncRNA-p21可调节SESN2(应激诱导蛋白Sestrin2)表达和mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)磷酸化,并通过AMPK/TSC2途径增强自噬,在缓解AngII诱导的内皮祖细胞(EPC)衰老中发挥作用。Zhuo X等[30]发现PPARγ可促进炎症、动脉粥样硬化和血管重塑等过程,进而参与高血压的发展。在SHR中上调lncRNA AK094457可抑制PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体),但同时也会加速Ang Ⅱ诱导的血管功能障碍。提示lncRNA AK094457参与高血压的进程,可能是治疗高血压的新靶点。lncRNA MALAT1通过抑制MyoD(在肌肉发育和生长中起着关键作用)的转录从而增强高血压大鼠心肌纤维化[31]。以上均提示lncRNA与高血压病密切相关。

1.3.3 circRNA Liu Y等[32]采用高通量RNA测序(RNA-seq)分析发现与正常大鼠相比,SHR主动脉血管组织中共发现485个差异表达circRNA,其中279个上调circRNA和206个下调circRNA,经RT-PCR分析证实,观察到rno-circRNA-0009197下调,rno-circRNA-0005818、rno-circRNA-0005304、rno-circRNA-0005506和rno-circRNA-0009301的上调,提示主动脉circRNA在调节高血压血管重塑和功能障碍中具有潜在作用。

1.4 RNA甲基化与原发性高血压

RNA甲基化隶属于表观转录组学与表观基因组学、蛋白质组学共同调控真核生物基因的表达,包括6-甲基腺嘌呤(N6-甲基腺苷,m6A)、5-甲基胞嘧啶(m5C)及1-甲基腺嘌呤(m1A)[33]。该修饰与心血管疾病、炎症反应以及癌症等有着密切联系。目前RNA甲基化与EH的相关研究主要集中在m6A。

周细胞是内皮细胞基底膜的组成部分,在内皮细胞损伤和微循环障碍的发病机制中起着重要作用,Wu等通过m6A测序技术(m6A-seq)比较SHR与正常大鼠,并取得一式三份的m6A-seq,在每个样品的mRNA上鉴定富集区即m6A峰。m6A甲基化在mRNA的编码序列(CDS)(特别是3'UTR和5'UTR)中显著富集,且SHR与正常大鼠相比,周细胞平均m6A信号降低。同时据基因本体(GO)和信号传导通路(KEGG)富集分析确定,m6A的甲基化水平与微血管周细胞中高血压的发展密切相关[34]。遗传变异通过改变靶点或关键核苷酸的RNA序列影响m6A, Mo调查大规模全基因组关联研究(GWAS),探究m6A 单核苷酸多态性(SNPs)与高血压的相关性,发现在GWAS-2011与2018数据中,DBP中GWAS的非m6A-SNP的比例明显低于m6A SNP且与DBP相关的SNPs显著富集了m6ASNPs。提示m6A SNPs(例如,rs9847953和rs197922)可能通过改变基因表达进而调节血压[35]。FTO是一种m6A去甲基化酶,同时压力诱导的阻力动脉收缩(定义为肌张力)是血管阻力和血压的主要决定因素,Krüger分别采用高脂肪饮食(HFD)和正常饮食(NC)诱导FTO基因缺失小鼠和正常小鼠对其三级肠系膜动脉进行了肌张力分析,发现FTO基因缺失小鼠的肌源性张力可以免受因HFD诱导的动脉缩小,提示内皮FTO的丢失对血管阻力具有保护作用。之后对主动管腔直径和被动管腔直径的进一步分析,发现内皮FTO的损失拮抗压力诱导的收缩[36]。以上研究均提示,m6A与高血压进程密切相关。

2 针灸治疗高血压的表观遗传机制

由上述研究成果分析可知,高血压与表观遗传修饰有着密不可分的联系,各类表观遗传修饰在高血压的发生发展中具有关键作用。而针刺作为国家传统医学的一部分,可通过疏通经络、调节阴阳和通调气血等多功效达到降压的目的[37],但是针刺降压相关机制仍未完全明确。目前研究发现针刺的整体性和多靶点作用与表观遗传学理论能够很好地契合[38],因此以表观遗传学视角探究针刺治疗高血压的作用机制将为其提供分子生物学依据,成为新的研究方向。卢圣锋等在“理、法、方、穴、术”几个方面探讨针灸与表观遗传学的联系,如“用针之要在于调节阴与阳”,阴与阳可相互转化,这与表观遗传学中的相关蛋白酶作用具有相似性(甲基转移酶、去甲基化酶等);另有中医的 “整体观念”从分子生物学水平上与“结合遗传与环境,通过调控基因转录与表达实现治疗目的”的现代表观遗传学治疗疾病的思想有异曲同工之妙[6]。

2.1 针刺调控RAAS相关基因启动子甲基化降压

目前,针刺降压的表观遗传机制探讨仍处在初级阶段。在RAAS(肾素-血管紧张素-醛固酮系统)中,Ace是将血管紧张素原(Agt)转化为AngⅡ并介导高血压发生的关键酶;同时有研究证实基因启动子处于低甲基化水平时,基因处于高表达状态。吴星[39]在实验前期总结出针刺太冲穴调控原发性高血压大鼠血压与影响RAAS蛋白浓度有关, RAAS相关基因的蛋白表达增加将导致血压升高,且机体受到环境等刺激因素的影响,提示针刺可能通过影响甲基化修饰改变基因的转录表达。因此,研究者采用WGBS(全基因组重亚硫酸盐测序)对各组大鼠下丘脑室旁核进行甲基化分析,直接探究针刺太冲穴与基因表达的相关性。结果表明:干预后,Agt与Ace基因穴位组启动子的甲基化与相对应模型组相比,甲基化程度水平增高均具有统计学意义;为验证实验结果,研究者还检测了Agt基因与Ace基因的mRNA与蛋白表达的情况,证明差异具有统计学意义。以上提示针刺太冲穴确实可调控RAAS相关基因的甲基化修饰即改变启动子序列甲基化水平进而影响表达。因此,结合目前针灸降压的优势特点以及表观遗传学在原发性高血压发生发展的作用机制,笔者认为将表观遗传学理念引入针灸降压的机制研究中具有重要研究意义和价值。

2.2 针刺通过表观遗传修饰调控免疫系统降压

研究表明:在高血压模型鼠中,调节性T细胞 (Tregs) 含量减少,辅助性T细胞17 (Th17) 含量增加,而两种细胞数目在螺内酯治疗后发生改变,提示高血压病的发生与发展与二者之间的平衡有关[40]。已有研究发现针刺关元、足三里穴可以上调Treg细胞数量, 下调Th17细胞数量,调节Th17/Treg细胞平衡,进而降低血压[41];同时,有实验发现表观遗传学对相关免疫细胞也具有调节作用[42]:SCFAs是重要的HDAC抑制剂,SCFAs可以通过上调Treg细胞含量达到免疫抑制的功能,进而维持结肠的免疫稳态即组蛋白乙酰化修饰可以影响Treg细胞[43];组蛋白H3K27去甲基化酶Jmjd3可以选择性促进Th17细胞的分化[44]。由此推测,针刺可能通过调控表观遗传修饰影响免疫表达,进而发挥降压作用,这将是未来的研究方向。

2.3 针刺通过表观遗传修饰调控氧化应激反应

高血压的发生与发展与氧化应激反应具有密切联系,机体氧化和抗氧化平衡异常,将导致血压持续升高甚至出现血管损伤、重构和炎性反应[45]。NO作为血管内皮细胞(EC)损伤标志物以及血管内皮功能障碍本身与高血压关系密切[22]。研究表明[46]电针足三里、太冲穴可以增加SHR中NO的生物利用能力,针刺可以使血管内NO的含量增加,使机体的抗氧化能力增强,减轻对血管的损伤,进而达到降压效果。同时也有研究总结表观遗传因子:HDAC、DNMT(DNA甲基转移酶)和非编码RNA均可通过调节NO含量进而参与EC功能和功能障碍的调控[47],如促动脉粥样硬化搏动(PS)诱导Ⅲ类HDAC Sirt1的过表达,可以增强NO的生物利用度并防止EC功能障碍。那么针刺是否可能通过调节表观遗传因子的表达影响NO含量最终达到降压功效,这也是未来值得研究的方向。

综上,笔者认为从表观遗传修饰角度探究针刺调控免疫系统、氧化应激反应等可作为未来深入研究的方向,同时结合目前针灸降压的机制以及高血压与表观遗传学的关联性也可以筛选出针刺降压的优势靶点,为针刺降压机制开辟新道路,为新药开发提供新角度。

3 小结

针刺是以针具刺入人体的穴位,并通过手法量学、穴位配伍等发挥综合、整体和双向调节治疗作用的一种中医治病方式,与表观遗传的特征具有相似性。但针刺治疗疾病的作用机理以及相关分子生物学依据都尚未有全面地阐述,且仅在动物实验中初步证实的调控位点也未经临床验证。近年来,国家自然科学基金涉及到表观遗传学探讨中医治疗疾病机制的多个方面,这对将表观遗传学机制引入针刺治疗原发性高血压具有积极意义。

表观遗传现象是由环境因素引起的生物细胞内遗传物质变化的结果,未来研究中或可采用全基因组DNA甲基化图谱、ChIP-seq和RNA-seq等方式在基因表达水平方面量化表观遗传学变化以制定个体化的针灸降压处方,即将表观遗传机制作为靶标纳入高血压靶器官损害早期的筛查靶点。但该视角仍存在局限性:基因水平层面确诊疾病是否会增加诊断的负担以及该诊断方式需要技术的进一步发展。另外,以量化的表观遗传学修饰水平(相关蛋白酶的表达情况或甲基化、乙酰化阳性率)为靶标,也可用于疾病的预防。“整体观念”是中医理论的核心,针刺可整体调节机体功能和状态,从表观遗传学机制角度进行深入研究为针灸防治疾病提供了新的方向,即针灸通过干预表观遗传学修饰,调节基因的表达,提早调整机体的异常状态。然而,表观遗传机制与中医干预如何有机地结合仍具有挑战。这也是中医现代化研究的一个重要方向。

最后,相信结合针灸降压的研究基础和表观遗传学机制与高血压疾病的相互关联,进行表观遗传学视角下的针刺降压机制探究,将会为针刺降压的分子生物学水平研究提供新的依据。