2例犬口腔肉瘤的病理学分析

苏 真,惠天朝,韦方华,徐亚嵩,张舒六,许世军,吴旧生,师福山,林 琳,王华南

[1. 浙江大学动物医学中心 教学动物医院,浙江 杭州 310030 ; 2.浙江大学动物科学学院 动物医学系 ,浙江 杭州 310030 ; 3.元医(杭州)科技有限公司 元医动物医学诊断实验室,浙江 杭州 310059]

口腔是犬、猫肿瘤生长的常发部位,据报道,全部犬肿瘤中,口腔部位发病率占6%～7%[1-3],按发病率从高到低,常见的犬口腔肿瘤依次是恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌(Squamous cell carcinoma)和纤维肉瘤(Fibrosarcoma),高发口腔肿瘤多来源于间叶组织[3]。软组织肉瘤(Soft tissue sarcoma,STS)是间叶组织来源的肿瘤,发病部位包括脂肪、肌肉、神经和神经鞘、血管及其他结缔组织,约占所有犬肿瘤的15%,多发于犬的皮肤和皮下组织,在口腔中的发病率较低,每年约为35/100 000[4]。STS代表一组形态相似但病变不同的肿瘤,由于分化程度低,具体种类难以从外观和细胞形态学上鉴别。口腔恶性黑色素瘤(Oral melanoma,OM)在犬口腔肿瘤中占15%～20%,是口腔肿瘤病变和黑色素瘤的最常见形式[3,5],源于口腔黏膜上皮中的神经嵴衍生黑色素细胞的恶性转化[6],具有一定的遗传性和年龄好发性[7]。在犬中,OM常见于7～14岁或以上的中老龄犬和体重小于23 kg的小型犬[8-9]。OM虽具有高免疫原性,可以考虑免疫治疗等途径,但由于高转移倾向和对常规治疗的强抵抗力,预后很差,患犬术后1年的存活率仅20%[10],OM几乎是致命的,因此尽早的诊断和及时的治疗至关重要。STS的某些病理形态特征与无色素沉着的黑色素瘤(Amelanotic melanoma)具有极大的相似性,外观和细胞形态学上难以区分。免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)作为特异性鉴别肿物类型的技术手段在人医领域已广泛使用,但在国内的兽医领域应用较少。若临床上难以根据苏木精-伊红(Hematoxylin and eosin,H.E.)染色判断肿瘤具体种类时,可以通过IHC染色进行鉴别诊断,并为肿瘤的靶向治疗提供依据。本试验对犬口腔软组织肉瘤和恶性黑色素瘤进行鉴别诊断,为犬口腔肉瘤的深入研究和治疗提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集 1号犬:13岁,雄性,已去势,口腔右侧有一系列肿瘤样组织。取灰白色不规则组织3块,其中4.0 cm×3.0 cm×3.0 cm大小的2块,3.0 cm×1.5 cm×1.0 cm大小的1块,切面均灰白质韧。2号犬:12岁8个月,雄性,口腔内和颈部皮下淋巴结附近肿大,均经手术切除。取口腔内组织2块,大小均为4.0 cm×4.0 cm×3.0 cm,1块切面呈白色和深褐色,质中,质地不均一;1块切面呈深褐色,质中,质地相对均一。取颈部肿物4块,大小均为3.5 cm×4.0 cm×2.0 cm,切面呈褐色,质软,质地不均一。取材后肉眼观察病变。

1.2 主要试剂 福尔马林固定液(10%、500 mL),购自泰州思研生物科技有限公司;二甲苯(20220517),购自湖州双林化学科技有限公司;无水乙醇(2204073606)、95%乙醇(20220326)和75%乙醇(2203134303),均购自安徽安特食品股份有限公司;苏木精染色液(PH0516)、伊红染色液(PH0516)、分化液(PH1813)、返蓝液(PH1330)和中性树胶(PH0407),均购自福州飞净生物科技有限公司;鼠源波形蛋白(Vimentin)抗体(UMAB159)、鼠源细胞角蛋白(Ckp)(广谱)抗体(AE1/AE3)、鼠源黑色素-A(Melan-A)抗体(A103)、鼠源人类黑色素瘤标记物-45(HMB45)抗体(HMB45)、鼠源人角蛋白抗原决定簇(Cam5.2)抗体(OTT1B12)、鼠源抗上皮细胞膜抗原(EMA)抗体(GP1.4)、鼠源抗α-平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体(UMAB237)、兔源抗中间丝状体蛋白(Desmin)抗体(OTIR4A8)、兔源抗肌细胞生成素(Myogenin)抗体(EP162)和钙结合蛋白(S-100)抗体(兔多抗),均购自中杉金桥生物技术有限公司;免疫组织化学试剂盒和DAB显色液,均购自Leica BIOSYSTEMS。

1.3 主要仪器 载玻片(10127101P-G)和盖玻片(10212440C),均购自江苏世泰实验器材有限公司;脱水机(KD-TS3A)、包埋机(KD-BM.BL)、冷冻台(KD-BM.BL)、摊片机(KD-P)和病理切片机(KD-P),均购自浙江省金华市科迪仪器设备有限公司;烤片机(GZM-9140MBE)和病理显微镜(Motic BA210),均购自浙江洛邦进出口有限公司;病理切片扫描仪(KF-PRO-005),购自宁波江丰生物信息技术有限公司。

1.4 石蜡切片的制作

1.4.1 固定与切片制作 将送检样本置于10%福尔马林固定液中固定24 h后,经过梯度酒精逐级脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、修块、切片(3 μm)、展片、烘烤,完成切片制作。

1.4.2 脱蜡与水化 将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各10 min进行脱蜡,梯度乙醇(高至低:100%、95%、80%和70%)各2 min水化后,水洗5 min。

1.5 H.E.染色 将石蜡切片放入苏木精染液中染色5 min后水洗返蓝,浸入1%盐酸乙醇30 s后立即取出水洗,浸入氨水1 min中和酸。水洗后将切片依次放入70%、80%、90%乙醇、100% 无水乙醇Ⅰ和Ⅱ中各1 min,进行脱水透明。浸入伊红染色液中染色2 min,后用无水乙醇脱水2 min,二甲苯Ⅰ和Ⅱ分别透明3 min和2 min,取出切片,滴加中性树脂封片,于病理显微镜下观察。

1.6 免疫组织化学检测

1.6.1 抗原修复 将1.4.2中脱蜡和水化后的石蜡切片浸入1 000 mL EDTA修复液煮沸2.5～3 min。冷却后用蒸馏水冲洗数秒,先后浸入3瓶相同PBS缓冲液内5～10 s,取出后,擦干组织周围残留液体。

1.6.2 血清封闭 将切片平放入湿盒内,滴加封闭剂,使得封闭剂液体完全覆盖标本组织,停留10～15 s后,弃去封闭剂,擦干组织周围残留液体。

1.6.3 一抗孵育 按比例稀释一抗,向每个标本滴加一抗(约100 μL),使液体完全覆盖组织,孵育1 h后清洗,操作同1.6.1。

1.6.4 二抗孵育 向每个标本滴加二抗,使液体完全覆盖组织,孵育30 min后清洗,操作同1.6.1。

1.6.5 显色 向每个标本滴加DAB显色液,反应5 min后清洗,操作同1.6.1。

1.6.6 复染和封片 用苏木精染色液复染10 s,水洗;再用返蓝液染色5～6 s,水洗;经无水乙醇充分脱水后,二甲苯透明湿封,干燥后于病理显微镜下观察组织病变。

2 结果

2.1 眼观病变 1号犬:口腔右侧牙龈肿物呈不规则鱼肉样和圆粒状分布,患犬的犬齿至臼齿均被其包裹(图1A)。2号犬:口腔下颌的2块肿物均呈中等大小(图1B),位于口腔臼齿附近的肿物表面呈褐白干酪状,位于口腔前庭右下臼齿到犬齿处的肿物呈红褐色,质软(图1C)。2块切除得到的新鲜肿物表面均呈光滑鲜粉红色,有局部无规则形状的黑色斑纹(图1B)。颈部肿瘤形似圆球,表面呈鲜粉红色,粗糙鱼肉样分布(图1D)。

图1 2例患犬口腔肿物外观Fig.1 Appearance of oral masses in two affected dogsA:1号犬口腔肿物; B:2号犬口腔肿块(左:7.0 cm×5.0 cm×3.0 cm,右:6.0 cm×3.0 cm×3.0 cm); C:2号犬口腔肿物;D:2号犬颈部肿块(6.5 cm×6.5 cm×3.0 cm)A: Oral mass of Dog 1; B: Oral mass of Dog 2(Left: 7.0 cm×5.0 cm×3.0 cm, Right: 6.0 cm×3.0 cm×3.0 cm); C: Oral mass of Dog 2; D: Neck mass of Dog 2 (6.5 cm×6.5 cm×3.0 cm)

2.2 H.E.染色 低倍镜视野下,1号犬肿物上皮样细胞大量分布于黏膜下方,表面有炎症反应,细胞间散在坏死(图2A);2号犬大量梭形细胞浸润脂肪组织(图2B),侵犯涎腺组织(图2C),视野中有大面积出血和多处血管密集,大量粉红色基液和炎性细胞聚集成团,发生凝固性坏死现象(图2D)。2例患犬切片中皆可见梭形细胞弥漫增生,密部(图2E)和疏部(图2F)相间,形成束状(图2E)、漩涡状(图2G)等多种排列方式。高倍镜视野下,增生部位细胞具有多形性和异型性(图2H和2I,图2H还可见胞核异型性),明显核仁(图2H黑色箭头)和核分裂象(图2I绿色箭头),局灶可见黑色素颗粒(图2H红色箭头)或褐色沉积(图2I黄色箭头)。

图2 2例患犬口腔肿物组织的H.E. 染色观察Fig.2 H.E. staining observation of tissues from oral masses in two affected dogsA:1号犬上皮样细胞大量分布于黏膜下方,细胞间散在坏死; B:2号犬大量梭形细胞浸润脂肪组织; C:2号犬大量梭形细胞侵犯涎腺组织; D:2号犬大面积出血,大量粉红色基质和炎性细胞聚集,凝固性坏死; E:1号犬梭形细胞呈束状排列,弥漫性增生,排列密集; F:1号犬局部组织细胞排列松散; G:2号犬梭形细胞和卵圆形细胞呈漩涡状排列,弥漫性增生,排列密集; H:1号犬组织细胞多形性和胞核异型性明显; I:2号犬组织细胞具有明显的多形性和异型性(黑色箭头:核仁明显; 红色箭头:黑色素颗粒; 绿色箭头:核分裂象; 黄色箭头:褐色沉积)A: Abundant distribution of epithelioid cells beneath the mucosa in Dog 1, with scattered necrosis between cells; B: Massive infiltration of spindle-shaped cells into adipose tissue in Dog 2; C: Extensive invasion of spindle-shaped cells into salivary gland tissue in Dog 2; D: Extensive bleeding, with abundant pink matrix and inflammatory cell aggregation, coagulative necrosis in Dog 2; E: Bundled arrangement of spindle-shaped cells with diffuse proliferation in Dog 1; F: Loose arrangement of cells in the local tissue of Dog 1; G: Whorled arrangement of spindle-shaped and oval cells with diffuse proliferation in Dog 2; H: Significant pleomorphism and nuclear atypia in tissue cells of Dog 1; I: Pronounced pleomorphism and atypia in tissue cells of Dog 2(Black arrow: Prominent nucleoli; Red arrow: Melanin granules; Green arrow: Mitotic figure; Yellow arrow: Brown deposit)

2.3 免疫组织化学检测 结果如表1和图3所示,2例患犬肿瘤都显示了间叶组织来源的腺体上皮细胞、上皮样细胞和梭形细胞等各种形态的细胞中Vimentin呈阳性(图3A和3B),黑色素相关标记HMB45、Melan-A和S-100均呈阴性,肌源性标记Myogenin呈阴性。1号犬的肿物中,SMA仅在局部梭形细胞和血管壁细胞中呈阳性,在大部分增生组织呈阴性(图3C);Desmin在上皮样细胞中表达,但不在梭形细胞中表达(图3D);CKp在表面上皮呈阳性,但在肿瘤细胞呈阴性(图3E);EMA呈阴性。2号犬检测标志中,除了Vimentin呈阳性外,其余均呈阴性。

表1 2例口腔肉瘤犬的免疫组织化学分析Table 1 Immunohistochemical analysis of the two cases of oral sarcoma in dogs

图3 2例患犬口腔肿物组织的免疫组织化学染色观察Fig.3 Immunohistochemical staining observation of tissues from oral masses in two affected dogsA:1号犬Vimentin检测; B:2号犬Vimentin检测; C:1号犬SMA检测; D:1号犬Desmin检测; E:1号犬CKp检测A: Vimentin detection in Dog 1; B: Vimentin detection in Dog 2; C: SMA detection in Dog 1; D: Desmin detection in Dog 1; E: CKp detection in Dog 1

3 讨论

STS眼观像假包膜的肉质肿瘤,边界不明,手术切除肿物后,常见局部复发,对化学药物治疗和放射治疗的反应通常很差[4]。OM具有特征性的黑色素颗粒沉着现象,但需要注意的是,在实际临床案例中,有近三分之一的OM并无色素沉着,形态特征与高级别肉瘤相近,因此常有漏诊发生[1,3,7]。

从眼观病变角度分析,蔡彤等[8]、张玉仙等[9]和叶明福等[11]观察到的几例黑色素瘤形态与本试验相似,肿物均呈红褐色,表面有黑色条纹分布。本试验中2例患犬口腔肿物的病理切片中可见大量梭形细胞增生和局部分布的褐色沉积细胞,因此,首先考虑黑色素瘤的可能性。需要注意的是,在病理组织学层面观察到的褐色沉积细胞不一定就是黑色素瘤细胞,可能存在正常基底黑色素细胞增生、巨噬细胞吞噬黑色素颗粒和切片制作过程中存在污染等情况。因此,仅根据H.E.染色观察难下定论。

从组织细胞学角度分析,本试验2例患犬口腔肿物的病理切片在形态上均具肉瘤的典型特征,即存在组织、细胞和胞核等多个层面的多形性,部分细胞可见核分裂象;梭形细胞弥漫增生,呈束状或巢状排列,其间充满粉红色黏液基质;组织表面可见溃疡,显微镜下可见炎性细胞聚集;细胞生长没有明显边界;此外,2号犬的H.E.染色切片上可见明显的浸润性增长。蔡彤等[8]和张玉仙等[9]观察到的几例黑色素瘤中,均有明显的核分裂象和细胞异型性等特征,与本试验病例的特征类似。低分化度恶性肿瘤生长较快,短期内可形成明显的肿块,并且由于诱导血管形成和营养供应相对不足,易发生坏死和出血等继发改变。2号犬的肿块大面积出血,继发炎症感染,与肿瘤的恶性增生密切相关。由于OM具有多种细胞形态、组织学类型和间质变化,亦可出现不同程度的促纤维形成、黏液样变性、炎性细胞浸润或间质肉芽肿性改变等多种复杂病变[7],在细胞形态学上很难对恶性黑色素瘤与软组织肉瘤进行鉴别诊断。

从免疫组织化学的角度而言,Vimentin是正常间叶细胞及其来源的肿瘤的特异性标志,在2例患犬口腔肿物切片中Vimentin的阳性表达进一步确认了2例肿瘤均为间叶来源的肉瘤。Cam5.2、CKp和EMA均为上皮来源标记,2例患犬口腔肿物的CKp均呈阴性,基本可排除低分化癌(Poorly differentiated carcinoma)的可能。1号犬的EMA检测呈阴性和2号犬的Cam5.2检测呈阴性的结果,进一步排除了肿瘤上皮源性的可能。

恶性黑色素瘤的典型免疫组织化学检测结果为HMB45、Melan-A、S-100和Vimentin呈阳性[12]。HMB45标记未成熟的黑色素颗粒,灵敏度不高但特异性强;Melan-A是间叶组织来源标记,用于黑色素细胞瘤和转移性肿瘤的鉴别诊断,具有高敏感度[3];S-100是神经组织来源标记,可在唾液腺和少数间叶组织中呈阳性表达,而切片中只有细胞间质和极少部分的细胞胞质呈弱阳性,不在作为阳性反应部位的细胞核表达,由此可先排除神经鞘瘤(Peripheral nerve sheath tumors)的可能。3种恶性黑色素瘤的常用标志物均不在各自的标记部位表达,基本排除OM的可能性。

世界卫生组织(World Health Organization,WHO)对犬口腔肿瘤的分期标准,可为STS的判定提供依据。2例患犬口腔肿瘤直径均大于4 cm,没有淋巴结转移和远处转移现象,属于第3期[12],恶性程度严重。2号犬颈部肿瘤未发现淋巴结构组织,是口腔肿瘤的多结节生长或者普通颈部转移。肉瘤的区域淋巴结转移较为罕见,多通过血液途径转移,有高达25%的病例报道称肉瘤通过血液转移[4];而在OM中,75%的病例存在淋巴结或肺部转移[2]。

纤维肉瘤由恶性成纤维细胞和产生胶原的混合间质细胞构成,瘤体质地坚实,形状不规整,边界不清,可长期生长而不扩散。纤维肉瘤内血管丰富,因而切除和活检时容易出血[13]。本试验2例患犬肿瘤外观和H.E.染色结果与纤维肉瘤的特征接近,但相较于生长缓慢、大多数为良性的纤维肉瘤,本试验中的肿瘤生长速度快,恶性程度高。

1号犬的口腔肿物切片中,另有SMA和Desmin呈阳性表达,应考虑肿瘤的肌源性。α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,SMA)存在于血管壁和各种组织间质中,可在肌成纤维细胞和肌上皮细胞中表达,主要标记平滑肌和肌上皮细胞[14];Desmin是一种肌节间蛋白,也称为细胞骨架蛋白,主要分布于肌肉细胞膜、肌节间膜和细胞核膜[15]。1号犬SMA免疫组织化学检测结果显示,只有部分肌纤维细胞的胞浆呈褐色,说明局部伴肌纤维母细胞分化;Desmin免疫组织化学检测结果显示,上皮样细胞呈阳性表达,而梭形细胞中表达较少。有关平滑肌肉瘤(Leiomyosarcoma)等肌源性肿瘤的研究显示,当SMA或至少2种肌源性标志物的免疫组织化学结果呈阳性时可纳入案例整合分析[16],但要精确推断是哪种类型的肌源性分化,目前尚未找到最适合的抗体组合[17]。本试验可以确定1号犬的肿瘤部分来源于肌组织。

综上,2例患犬口腔肿瘤均属于STS,其中1号犬为肌源性恶性肿瘤,2号犬为高级别肉瘤。STS因其局部侵袭性和预后局部高复发率,应及时进行局部肿瘤治疗,尤其是对于无法完全切除的软组织肉瘤,术后一般采用放射治疗和以阿霉素为基础的辅助化疗[18]。近年来研究表明,在人医领域发现程序性死亡受体-1(Programmed cell death-1,PD-1)与程序性死亡受体-配体1(Programmed cell death-ligand 1,PD-L1)结合的靶向治疗对STS均有一定的疗效[19]。本试验通过实验室的免疫组织化学方法完成了2例口腔肉瘤的精确诊断,大大提高了临床病例诊断的科学性,有助于为患宠提供更优的治疗方案。同时,在靶向治疗和基因疗法研究盛行的当下,期待未来免疫组织化学方法能被更多兽医临床诊断所使用,为下一步的精准治疗提供参考。