猪副伤寒的中药防治研究进展

龚诗淼,杨 植,王煜轩,刘晓晔,董 虹

(1. 北京农学院 兽医学中医药北京市重点实验室,北京 昌平 102206 ; 2. 北京农学院 北京市中兽药工程技术研究中心,北京 昌平 102206)

肠道是机体消化和吸收营养物质最主要的场所,也是抵抗病原菌入侵机体的第一道防线。集约化养殖模式下,消化系统疾病尤其是肠道疾病频发,严重制约了畜禽养殖业的发展。猪副伤寒是临床猪细菌性肠道传染病之一,多引起仔猪腹泻、肠炎和败血症等,其主要病原沙门菌属胞内寄生,清除难度大。

沙门菌侵袭肠道后诱导肠道上皮细胞凋亡,破坏肠道屏障,进一步诱导肠道巨噬细胞和内皮细胞焦亡,引发肠道炎症并抑制中性粒细胞溶菌酶释放,不利于病原体清除。同时,沙门菌不仅有宿主广泛性,还是人类食源性感染的主要病原,具有重要的公共卫生意义,对人类健康造成极大的威胁。中医认为,猪副伤寒属湿热内蕴,湿、热稽留三焦,水谷之精无法吸收,导致水道运化不畅,机体无力抗邪[1]。利用清热类药物辨证施治,不仅可以发挥中药毒副作用小、药物残留低的优势,还能替代抗生素在临床中广泛应用,降低猪副伤寒治疗成本,保障猪源食品安全,具有良好的治疗和应用前景。

本文对猪副伤寒的危害、特点和防治现状以及该病的中医辨证进行了探讨,并检索了中药调控细菌性肠道疾病、革兰阴性菌感染和细胞焦亡的相关文献,分析清热类药物可用于猪副伤寒的诊治和防控,以期为猪副伤寒临床用药提供参考依据。

1 猪副伤寒的危害、特点和防治现状

1.1 猪副伤寒对我国养猪业的危害和特点 据农业农村部公示,2017年四季度全国共报告发生猪病25种,报告发病数前三的猪病为猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和猪副伤寒。其中,猪副伤寒传染性强、感染率高,且常与猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征等发生混合感染,产生巨大的经济损失。猪副伤寒主要病原沙门菌属胞内寄生,不易受免疫系统控制,因此该病的防治具有难度,且作为人畜易感病原,沙门菌对人类食品安全也具有极大危害。目前,我国畜禽养殖过程中大规模实施以抗生素为主的抗菌治疗策略,其中70%～80%的抗生素用于肠道细菌性疾病的治疗。然而,抗生素在养殖端的大量不合理使用致使细菌耐药性突变加速,而新型抗菌药物研发相对滞后,致使畜禽养殖中细菌性疾病防控面临更大的挑战;除此之外,抗生素的不合理使用还会破坏畜禽肠道微环境,打破肠道正常微生态系统平衡,降低畜禽免疫力,且其残留问题影响动物源性食品安全。

猪副伤寒急性型常表现败血症症状,慢性型多以坏死性肠炎为特征,有时出现卡他性或干酪性肺炎[2]。该病的病原主要是鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌和猪伤寒沙门菌[3]。病猪和无症状带菌猪是主要传染源,可经分泌物和生殖道排菌,本病主要经消化道感染。健康猪带菌(特别是鼠伤寒沙门菌)较为普遍,当受外界因素影响或动物抵抗力下降时,常导致内源性感染。该病四季均可发生,阴雨潮湿季节多发[4],主要侵害6月龄以下仔猪,尤以1～4月龄仔猪多发。该病临床以腹泻为主要特征,粪便中含有泡沫,便酸臭,患猪体温升高、畏寒,被毛无光泽。

在致病机制方面,当沙门菌入侵猪肠道时,侵袭肠上皮细胞,诱发Caspase-8介导的细胞凋亡,造成肠道屏障损伤,且沙门菌在细胞中大量增殖后扩散至肠腔中侵染更多细胞。随病程加深,沙门菌在肠上皮细胞内增殖,释放大量内毒素,入侵肠壁固有层中的巨噬细胞,激活Caspase-1介导的细胞焦亡通路并释放炎性因子,造成肠道炎症(图1)。

图1 沙门菌侵袭肠道机制示意图(由Figdraw绘制)Fig.1 Schematic diagram of Salmonella invasion of intestinal tract mechanism (Drawn by Figdraw)NLRP3:NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3; ASC:凋亡相关斑点样蛋白; Pro CASP-1:含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1前体; CASP-1:含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1; CASP-8:含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8; IL-1:白细胞介素1; IL-6:白细胞介素6; IL-8:白细胞 介素8; GSDMD:Gasdermin家族蛋白DNLRP3: NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3; ASC: Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD; Pro-CASP-1: Pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1; CASP-1: Caspase-1; CASP-8: Caspase-8; IL-1: Iinterleukins-1; IL-6: Iinterleukins-6; IL-8: Iinterleukins-8; GSDMD: Gasdermin D

本课题组前期研究表明,中性粒细胞(Polymorphonuclear neutrophils,PMNs)能够通过跨内皮细胞迁移募集于感染或损伤区域,释放溶菌酶,利于病原的清除[5-8]。沙门菌侵染上皮细胞造成炎症后,炎症组织释放的特殊分子作用于内皮细胞,增加细胞表面黏附分子表达水平,与PMNs上的糖蛋白结合,随后通过不断地形成和中断这些黏附分子的相互作用,使PMNs沿着血管内皮缓慢移动,并跨内皮细胞迁移至趋化因子浓度高的炎症部位,释放溶菌酶等因子抵抗病原。沙门菌识别并结合内皮细胞膜上的特异性受体,破坏血管内皮细胞屏障功能,导致内皮细胞焦亡,虽然PMNs迁移增多,但溶菌酶的激活受到抑制,机体对沙门菌的抵抗能力降低(图2)。

图2 沙门菌侵袭内皮细胞机制示意图(由Figdraw绘制)Fig.2 Schematic diagram of Salmonella invasion of endothelial cells mechanism (Drawn by Figdraw)IL-1:白细胞介素1; TNF:肿瘤坏死因子IL-1: Iinterleukins-1; TNF: Tumor necrosis factor

1.2 猪副伤寒的防治现状 目前,治疗猪副伤寒的主要药物是盐酸多西环素、氟苯尼考、恩诺沙星、复方磺胺对甲氧嘧啶钠和土霉素等抗生素类药物[9]。但抗生素的应用有诸多风险,如剂量安全问题、长期应用的耐药性问题、药物残留问题和食源性污染等,使养殖业面临巨大考验。近年来,随着“减抗”、“替抗”等政策的实施与推进,中药在养殖业中作用愈加重要,无论用于防治疾病还是饲料添加,其效果均得到了临床验证。

有学者应用组方治疗猪副伤寒,方剂以黄芩、栀子、连翘、黄柏和黄连等清热药为主,辅以猪苓和泽泻等化湿药,疗效显著[10]。通过对比分析发现,多个治疗猪副伤寒的组方[11-12]中清热药占比较大,并辅以补虚药,符合中医扶正祛邪的治则。有临床研究表明,以清热药为主的中药复方,以汤剂口服的效果优于散剂[13]。一些商品化中草药药剂已被证实用于治疗猪副伤寒具有较好的临床疗效[14],可见中药治疗猪副伤寒行之有效。

2 中医辨证和中药调控思路

2.1 猪副伤寒的中医辨证 中医理论认为,猪副伤寒系湿热内蕴所致,湿热之邪弥漫三焦。因肺合皮毛,高热不下且呼吸困难、皮肤有紫斑属上焦湿热范畴;脾脏、肝脏和肺脏等脏器气血瘀滞,腹痛、下痢属中焦湿热范畴;肾脏充血、肿大属下焦湿热范畴。湿热共同作用于脏腑,致使脏器气血瘀滞,伴有高热、腹痛、下痢,秽浊郁腐。湿易郁气机,热易化燥伤阴,因此“扶正祛邪,清热养阴”为该病的主要治疗原则。

2.2 恢复机体机能以“扶正”,提高机体抵抗力

2.2.1 改善屏障功能,增强防御能力 肠壁屏障作为肠道免疫防线,可以防御和抵制病原入侵,中药的应用可以改善肠壁屏障功能,增强肠道的免疫能力,从“扶正”角度抵御病原。中药及其有效成分能够通过不同机制对肠壁屏障功能进行调节,复方大承气汤加强分泌型免疫球蛋白A(Secretory immunoglobulin A,sIgA)的合成和分泌[15]、血必净调控凋亡基因P53的表达[16],均是通过保护肠壁黏膜以增强屏障功能;苦参碱通过增强紧密连接蛋白表达对肠壁黏膜屏障进行修复[17];四君子汤通过促进杯状细胞分泌黏蛋白以降低肠壁黏膜通透性[18],从而增加肠道对病原的防御能力,减少病邪入侵。

内皮细胞作为血管屏障,其表面黏附因子能够与PMNs表面糖蛋白相互作用,促进PMNs跨内皮迁移至炎症部位。研究表明,白头翁汤能够通过Toll样受体4-细胞外调节蛋白激酶(Toll-like receptor 4-extracellular regulated protein kinases,TLR4-ERK1/2)信号通路缓解内皮细胞炎症反应[19],从而保证PMNs正常跨内皮迁移,释放溶菌酶。

综上所述,中药能够通过增强肠壁屏障有效抵御沙门菌对仔猪肠道的侵袭,同时保护作为血管屏障的内皮细胞,保证细胞功能,加强机体抵御沙门菌侵袭的能力。

2.2.2 调节肠道微环境,提高免疫力 肠道中的微生物群会受猪品种、生长阶段和所处空间位置等因素的影响,肠道微生物群对肠道健康发挥重要作用,菌种组成和丰度的变化会导致肠道稳定状态改变,降低肠道抵抗力,使得病原有机可乘。中药能够调节肠道菌群,恢复肠道有益微生物丰度,增强肠道防御能力。如表1所示,大量研究表明,不同类型的方剂及中药有效成分能够通过对肠道菌群的调节,恢复肠道健康稳定状态以抵御病邪入侵。

表1 近5年中药调节肠道菌群相关研究Table 1 Research on regulation of intestinal flora by traditional Chinese medicine in recent 5 years

综上所述,中药能够通过调节患猪肠道菌群,增加有益菌丰度,建立肠道微生物屏障,为机体抵抗沙门菌助力,从而防控猪副伤寒。

2.2.3 调节细胞内环境,减轻肠道炎症 肠道炎症发生时,细胞内存在大量炎性因子,炎性因子过多会使细胞内阴阳失衡,导致细胞功能过度。可通过调节细胞内环境,减少细胞内炎性因子,为细胞“扶正”,从而达到恢复细胞机能的目的,进而减轻肠道炎症。在中医范畴,肠道炎症具有多种证候,依据传统中医因证施治的原则,对不同证候的治疗应通过辩证选用不同的方剂,同时根据患畜的具体症状对组方药物进行加减。肠道炎症是一系列复杂证候,传统中医辨证理论可将其大致分为:大肠湿热证、脾虚湿蕴证、脾肾阳虚证、脾气亏虚证、寒热错杂证和热毒炽盛证[41]。肠道炎症是猪副伤寒最主要的症状,其特征更符合上述辨证中的大肠湿热和热毒炽盛。

芪英汤可降低妊娠母猪白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)分泌水平,解热毒,从而降低低胎次母猪的死胎率、弱胎率和死亡率[42];白头翁汤通过抑制TLR4-ERK1/2信号通路缓解内毒素脂多糖(Lipopdysaccharide,LPS)所诱导的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(Rat intestinal mucosa microvascular endothelial cells,RIMVECs)炎性反应[19],发挥抗炎作用以调节细胞内环境,恢复细胞机能;白薇水煎液能够较好地保护肠黏膜,抑制LPS所致血清中淀粉样蛋白A(Serum amyloid A,SAA)、卵转铁蛋白(Ovotransferrin,OVT)、α-1-酸性糖蛋白(α-1-acid glycoprotein,AGP)和IL-1β的高表达[43],以“祛邪”。大肠湿热证应用清热化湿方,不仅可以减轻肠道炎症,还能增加肠道益生菌丰度[44-46];热毒炽盛证应用清热解毒方,可明显缓解葡聚糖硫酸钠(Dextran sodium sulfate,DSS)诱导的小鼠肠道炎症,恢复肠道内乳酸菌丰度[33-34],有益菌能够调节肠道内环境,进而调节细胞内环境,从而减轻炎症,达到“祛邪”的目的。清热化湿和清热解毒方剂的应用也符合猪副伤寒辨证下的清热治则。

而随着沙门菌入侵病猪肠道,激活巨噬细胞和内皮细胞经典焦亡通路,炎症小体和焦亡蛋白的活化一方面促进IL-1β等炎性因子分泌,另一方面激活Gasdermin D(GSDMD),导致细胞膜打孔,释放炎性因子,加剧炎症。有学者认为,与机体一样,细胞也存在阴阳属性[47],若阴阳失衡,会导致细胞状态改变。细胞焦亡过程是动态的,当细胞受到危险信号激活时,若细胞功能正常,细胞属阳胜于阴;当受到过度激活后,细胞功能受到抑制,出现阴胜于阳。属“阴”的物质不断增长,“阳”的机能不断减退,细胞内物质过度耗竭,则会出现阴阳离决,细胞死亡[48]。

目前,已有许多学者对中药调控细胞焦亡的机制进行了深入的探究,其中中药有效成分的作用在多组织中得到了验证,白芍总苷可能抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associatec protein 3,NLRP3)介导的Caspase-1依赖的心肌细胞焦亡[49];大黄素可以缓解缺氧条件下的NLRP3介导的Caspase-1依赖的细胞焦亡[50];白藜芦醇可以通过NLRP3通路降低肺部的细胞焦亡[51];益母草可缓解大脑组织的细胞焦亡[52];丹参酮ⅡA[53]、冬凌草甲素[54]和雷公藤多苷[55]亦可通过NLRP3通路减轻细胞焦亡;姜黄素能够拮抗氧化三甲胺诱导的静脉血管内皮细胞焦亡和线粒体功能障碍[56];天然黄酮类化合物异荭草素可以抑制Caspase-1的表达从而预防焦亡性肝损伤[57];黄连素能够抑制细胞活性氧的产生,从而减少Caspase-1引起的非酒精性脂肪肝模型中细胞焦亡的发生[58];灯盏花乙素能改善血管内皮细胞损伤,其机制是通过下调NLRP3/Caspase-1通路[59]。

除此之外,中药组方也具有调控细胞焦亡的效果,清心解瘀方可抑制NLRP3炎症小体活化引起的细胞焦亡[60];调肺饮可改善呼吸道症状,其机制可能与抑制NLRP3 mRNA/NLRP3/IL-1β细胞焦亡通路表达相关[61];参苏饮可通过抑制NLRP3炎性小体的活化减轻肺部细胞焦亡[62];二陈汤[63]、清燥救肺汤[64]、桂枝芍药知母汤[65]和蛭龙活血祛瘀胶囊[66]亦是通过NLRP3通路发挥药效。

针对肠道细胞焦亡和炎症的研究表明,参苓白术散可通过下调Caspase-1和Casepase-11两条细胞焦亡通路中相关指标以缓解溃疡性结肠炎[67];黄芪可通过抑制硫氧还蛋白互作蛋白,减少Caspase-1表达,从而减轻肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)诱导的细胞焦亡[68];加味三黄汤灌肠液可以降低NLRP3的表达从而抑制Caspase-1活化,以治疗溃疡性结肠炎[69];中药复方溃结灵也是通过调控Caspase-1通路减少溃疡性结肠炎所致细胞焦亡[70],通过抑制焦亡蛋白以减少炎性因子的表达,调控肠道炎症。抑制肠道中沙门菌诱导的细胞焦亡水平,可以限制沙门菌的感染[71]。

综上所述,沙门菌入侵肠道细胞时造成细胞焦亡,破坏细胞内环境,释放大量炎性因子,加剧肠道炎症。中药一方面通过调节细胞内环境,另一方面通过抑制沙门菌感染后细胞焦亡水平,以限制炎症进一步发展,不仅能够缓解炎症,恢复细胞正常机能状态,达到“扶正”的目的,也能有效避免抗生素导致的耐药问题,更适合养殖业的长期用药。

2.3 消除病原以“祛邪”,改善机体内环境

2.3.1 阻断或减弱细菌毒力因子,控制肠道感染 细菌性肠道疾病的发展是一个复杂的过程,细菌入侵肠道后大量增殖并释放毒素,损伤肠道。中药可通过调控细菌生物膜的形成、破坏细胞膜和细胞壁、抑制菌体内酶活性、干预蛋白质合成、影响相关基因表达和阻断群体感应系统等多种方式抑制细菌,应用中药“祛邪”,直接作用于病原,控制病程进一步发展,其效果在多种感染肠道的细菌抑制探究中得到证实。猪副伤寒主要病原沙门菌属革兰阴性菌,类比多种中药抑制革兰阴性菌的辨证治疗,可为猪副伤寒的中药诊治提供参考。

黄酮类中药能够通过抑制溶血素基因编码、基因转录或直接中和溶血素等途径抑制细菌[72];黄连可通过抑制鸡源大肠杆菌主动外排系统,降低其生物膜黏附性,从而起到抑菌作用[73];五倍子、五味子、乌梅、诃子、女贞子、石榴皮、苏木和黄芩均对导致犊牛腹泻的多重耐药沙门菌具有良好的抑制作用[74];白头翁、夏枯草和白夏汤能够抑制铜绿假单胞菌感染,促进患者创面愈合[75];白头翁、金银花、五倍子、秦皮、黄连和大青叶对临床分离大肠杆菌具有体外抑制作用[76];诃子、五味子和黄连对貉源大肠杆菌不仅发挥抑菌作用,还能提高大肠杆菌对抗菌药的敏感性[77];五倍子、黄芩、金银花和山楂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用较强,对白色念珠菌也有一定的抑制作用[78];含有穿心莲、黄连和连翘的中药复方可能通过破坏菌体结构,抑制细菌呼吸代谢以抑制O2型鸡大肠杆菌临床分离株[79];黄芩与五倍子配伍对抑制多重耐药鲍曼不动杆菌有协同作用[80];榆栀散组方能够通过破坏细菌结构完整性起到抑制大肠杆菌的作用[81]。同样,中药也可与抗菌药物协同作用,含扶正透邪解毒化瘀方的大鼠血清联合抗生素能够抑制多重耐药铜绿假单胞菌[82];黄芩、五倍子、乌梅、秦皮和五味子通过消除耐药沙门菌的耐药作用联合β-内酰胺类抗菌药物起到抗菌作用[83]。

以上研究中以清热类中药为主,其不仅能够抑制革兰阴性菌,还对同为肠道疾病病原的犊牛源沙门菌和貉源大肠杆菌等起到抑制作用,同时还能够减轻沙门菌的耐药性。此外,猪副伤寒辨证属湿热内蕴,清热类中药也符合辨证下的治则。清热药还具有抗菌、抗炎、抗病毒、解热和抗肿瘤等药理作用。通过已有研究可以推断,清热类中药可能通过抑制细菌作用减轻沙门菌的入侵,从而减少毒力因子的释放,降低肠道损伤程度,有效控制肠道感染,有利于机体清除病原。

3 小结与展望

猪副伤寒主要病原沙门菌对公共安全危害极大。沙门菌属革兰阴性菌,通过类比其他革兰阴性菌感染、细菌性肠道疾病和炎症的中医辨证治疗,发现清热类药物及组方应用比例较高,作用机制研究明确,且符合猪副伤寒的中医辨证。

根据中医辨证,猪副伤寒属湿热稽留三焦,水道运化受阻致使机体无法尽水谷精微之用,无力抗邪,其用药原则应以清热除湿为主,同时辅以补益类药物以增强机体抗邪能力。中药一方面能够从改善肠道屏障、调节肠道菌群、减轻肠道炎症、抑制细胞焦亡角度对机体进行“扶正”,另一方面从抑制细菌角度进行“祛邪”,不仅能调动机体发病部位的抗病能力,还能直接对病原起到抑制作用,具有良好的应用价值。

应用中药对症治疗,可缓解细菌耐药问题,并保障用药安全。猪副伤寒用药多以复方为主,但养殖中应用成本相对较高,且对于新兽药的开发和应用,成分过于复杂不利于明确作用机理和品控。因此,对于猪副伤寒的临床防治,选择3～5味中药构成的清热类小复方更符合临床实际应用,不仅保证了用药安全,还具有药效优于单味药,成本低于大组方的优点。此外,病情严重时可将中药与抗菌药物协同使用,在提高疗效的同时缓解耐药性的产生,综合防治猪副伤寒。