云南昆明地区南瓜白粉病病原菌生理小种鉴定

高婷 李梅 朱彩华 龙荣华

摘    要：为明确云南省昆明市团结乡地区南瓜白粉病病原菌种类及生理小种，通过病原菌孢子形态观察、分子鉴定及国际通用的甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主与标准鉴定体系，对该地区的南瓜白粉病病原菌及生理小种进行鉴定。结果表明，该白粉病菌孢子形态呈椭圆形，内有纤维状体；rDNA-ITS序列与单囊壳属（Podosphaera xanthii）ITS序列聚为一类，一致性高达99%；病原菌样本对鉴别寄主的抗感反应与单囊壳白粉菌生理小种2France表现一致。因此，引起昆明市团结乡地区南瓜白粉病的病原菌为单囊壳属白粉病菌（P. xanthii）的生理小种2France。

关键词：南瓜；白粉病菌；生理小种

中图分类号：S642.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）01-076-05

Identification of physiological race of pumpkin powdery mildew in Kunming region

GAO Ting1， LI Mei2， ZHU Caihua1， LONG Ronghua1

（1. Horticultural Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650205， Yunnan， China; 2. Dongchuan Economic Crop Technique Popularization Station， Kunming 654100， Yunnan， China）

Abstract： In order to identify the species and physiological race of powdery mildew in Tuanjie region， Kunming， Yunnan province， the pathogen and physiological race of pumpkin powdery mildew in Tuanjie region were identified through the observation of pathogen spore morphology， molecular identification of ITS sequence， international common physiological races identification hosts of melon powdery mildew and its standard identification system. The results showed that the spores were oval in shape with fibrous bodies. The rDNA-ITS sequence was grouped with the ITS sequence of Podosphaera Xanthii， and the similairities was up to 99%. The resistance and susceptible response of the pathogen samples to the identification of the host was consistent with that of the physiological race 2France. Therefore， the pathogen causing powdery mildew of pumpkin in Tuanjie region of Kunming city was identified as race 2France of P. Xanthii.

Key words： Pumpkin; Powder mildew; Physiological race

南瓜是葫芦科（Cucurbitaceae）南瓜属（Cucurbita Linn.）一年生草本植物。目前，中国主要栽培的南瓜有4个种，即中国南瓜（Cucurbita moschata Duch.）、美洲南瓜（西葫芦）（Cucurbita pepo L.）、印度南瓜（Cucurbita maxima Duch.）和黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia Bouche），但黑籽南瓜一般用作砧木或者饲料。南瓜具有风味好、易栽培、药用价值高等特点，因此在我国种植广泛。据FAO统计（https：//www.fao.org/faostat/en/#home），2021年南瓜在中国的栽培面积为40.16万hm2，总产量为743.99万t。白粉病是南瓜严重且常见的病害，常造成产量降低，严重时甚至影响果实品质。

据报道，目前引起瓜类白粉病的病原菌是白粉病菌，主要有3个属：白粉菌属（Erysiphe）、内丝白粉菌属（Leveillula）及单囊壳属（Podosphaera），6个种分别是E. cichoracearum（又称Golovinomyces cichoracearum）、E. polygoni、E. polyphage、E. communis、L. taurica和P. xanthii（又称Sphaerotheca fuliginea）。P. xanthii报道最多，其次为E. cichoracearum[1]，这2个种是我国的优势白粉病病原菌[2]。P. xanthii已发现有11个生理小种，分别是生理小种0、1、2U.S、2France、3、4、5、N1、N2、N3和N4，E. cichoracearum目前有2个生理小种Race0和Race1W。截至2022年，我国瓜类育种工作者分别在甘肃[3-6]、贵州[7]、广西[8]、河南[9]、北京[10]、黑龍江[2，11-12]、陕西[13]、内蒙古[14]、安徽[15]、湖南[16]等地开展白粉病菌种类及生理小种鉴定，发现国内瓜类寄主上的白粉病病原菌均为单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii），但在不同地区致病生理小种有差异。主要的优势小种为2France和Race1，此外还存在N1、Race4，内蒙古地区还发现一未知的生理小种。而目前关于云南昆明地区南瓜白粉病生理小种的鉴定还未见相关报道。

南瓜在云南边远山区发展中具有重要意义，明确昆明地区南瓜白粉病病原菌生理小种，对该地区白粉病防治及抗病育种具有重大意义。笔者通过病原菌形态观察、分子鉴定以及13个白粉病甜瓜通用鉴别寄主侵染试验，确定昆明地区南瓜白粉病菌种类及生理小种，为今后该地区白粉病防治及抗病育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

采用国际通用的鉴别寄主：Iran H、Top mark、Vedrantais、PMR45、PMR5、MR29、Edisto47、PI414723、MR1、PI124111、PI124112、PMR6和Nantais Oblong，由北京大学现代农业研究院提供。白粉病寄主选用易感病南瓜自交系（云瓜1号），由云南省农业科学院园艺作物研究所保存。

南瓜感病自交系及13个国际通用鉴别寄主均种植在人工气候箱，用于病原菌分离与鉴定。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化 2022年7月在昆明市团结乡种植基地，于南瓜白粉病发病盛期采摘发病严重的南瓜叶片，吹去叶表的老孢子，用灭过菌的刷子轻轻将小孢子刷入瓶子中，滴加1～2滴Tween-20，随后加入蒸馏水制成孢子悬浮液，采用血球计数法在显微镜下调整浓度为2.5×105～5.0×105个·mL-1。于幼苗2叶至3叶1心时，将孢子悬浮液喷洒在南瓜幼苗上，以叶面布满孢子液又不流下为宜。随后先将幼苗置于25 ℃黑暗条件下24 h，然后在28 ℃、6000 lx、湿度80%、12 h与20 ℃、0 lx、湿度80%，12 h条件下交替培养，直至白粉覆满整个叶面。继代5次，活体保存，即可用于后续试验。

1.2.2 病原菌形态观察 将纯化后的病原菌孢子，轻轻抖落在载玻片上，滴加1滴3%KOH溶液，盖上盖玻片，在显微镜下观察白粉病孢子中是否存在纤维状体。制作3个玻片，对每个玻片至少在3个视野下观察孢子形态。二孢白粉菌E. cichoracearum的分生孢子呈细长圆柱形，没有纤维状体。单囊壳白粉菌P. xanthii的分生孢子呈椭圆形，有发达的纤维状体。

1.2.3 病原菌分子鉴定 用植物DNA提取试剂盒提取白粉病病原菌的DNA。利用真菌核糖体ITS区段通用引物ITS 1、ITS 4进行扩增，序列分别为5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR 体系为20 μL：DNA模板0.5 μL，上下引物各1 μL，2×Taq Master Mix（Vazyme）10 μL，ddH2O 18.75 μL。PCR反应条件为预变性94 ℃，5 min；变性94 ℃，30 s，退火50 ℃，30 s，延伸72 ℃，45 s，35个循环；再延伸72 ℃，10 min。通过1%凝胶电泳检测，纯化后，送至擎科公司测序。将ITS序列放入NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST比对，并使用DNAMAN进行多序列比对分析，采用MEGA构建系统进化树，用于构建系统进化树的序列来源于NCBI核酸数据库。

1.2.4 病原菌生理小种鉴定 将分离纯化后的白粉病菌，接种在国际通用的13个甜瓜鉴别寄主上。采用随机区组设计，每个品种3次重复，每个重复9株苗。接种时间、浓度、管理条件均与1.2.1一致。接种10 d后调查发病情况，每个重复超过2/3的接种叶片出现白色分生孢子层的为感病；所有接种叶片无症状或出现褐色坏死病斑的为抗病。寄主对不同生理小种的抗病、感病表现见表1。

2 結果与分析

2.1 病原菌形态

在显微镜下观察纯化后的白粉病菌孢子，结果如图1所示，试验中白粉病菌孢子为椭圆形，孢子内有纤维状体。因此，初步判断该病原菌为单囊壳白粉菌P. xanthii 。

2.2 病原菌分子鉴定

以昆明地区白粉病菌DNA为模板，ITS1、ITS4为引物扩增，得到一条约530 bp的片段（图2）。使用DNAMAN进行多序列比对分析，发现该南瓜白粉病菌与Podosphaera xanthii一致性高达99%（图3）。使用MEGA构建系统发育树，结果表明，样本病原菌（KMPW01）的ITS序列与其他单囊壳白粉菌（P. xanthii）聚为一类，而Golovinomyces cichoracearum聚为一类，Leveillula taurica聚为一类。通过分子鉴定，进一步证明了昆明市团结乡基地2022年度的南瓜白粉病菌种类为单囊壳属白粉病菌（P. xanthii）。

2.3 病原菌生理小种鉴定

将纯化后的白粉病菌接种至4叶1心的13个国际通用鉴别甜瓜寄主上，观察其发病情况。观察发现，接种后第10天，Nantais Oblong、PMR45、Iran H叶片出现病斑，第12天，Top mark、Vedrantais出现病斑；第15天，Nantais Oblong、PMR45、Iran H、Top mark、Vedrantais发病严重，其余均未发病。对比表1中的寄主抗感反应，初步确定昆明市团结乡基地的白粉病生理小种为单囊壳白粉菌P. xanthii的2France。

3 讨论与结论

目前关于区分P. xanthii和E. cichoracearum的方法，主要有形态鉴定和分子鉴定。形态鉴定通常通过光学显微镜观察分生孢子子囊性状及其是否具有纤维状体，P. xanthii分生孢子呈椭圆形，且具有纤维状体[10]。当上述方法不能区分二者时，可通过萌发管宽度来确定其种类，P. xanthii平均萌发管宽度是（4.3±1.16）μm，比E. cichoracearum的萌发管窄[17]。分子鉴定一般采用rDNA-ITS序列分析法。ITS序列存在于保守序列18S和28S之间，具有较高的多态性，表现为种内相对一致，种间差异较大，且片段较小，可用于区分不同种属的真菌。笔者通过形态鉴定和分子鉴定，发现昆明市团结乡地区的白粉病菌分生孢子呈椭圆形，具有纤维状体，其ITS序列与P. xanthii ITS序列一致性高达99%，对国际通用甜瓜鉴别寄主抗感反应与2France表现一致。因此，确定2022年度昆明市团结乡地区的白粉病菌为P. xanthii的2France。

大部分研究认为，P. xanthii有11个生理小种可侵染瓜类作物，但是早在2006年，Mccreight[18]提出P. xanthii已分化出28个小种可致病。我国学者马鸿艳等[12]、李书颉等[14]、包海清等[19]均在对白粉病生理小种鉴定时，发现了除11个小种以外的未知小种；此外，马鸿艳等[9]还发现，同一地区连续2年的优势生理小种会发生变化甚至消失。这些可能是白粉病菌基因组内存在着大量的逆转录转座子，从而使白粉病菌变异速度很快导致的，但具体原因还需要更进一步的探究。

综上所述，笔者通过病原菌孢子形态观察、分子鉴定及国际通用的甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主与标准鉴定体系，确定2022年度昆明市团结乡地区的白粉病菌为P. xanthii的2France，但病原物在与寄主互作的过程中种类或生理小种类型可能发生变异，需对同一地区白粉病菌连年进行观察，探索其种类和变化规律，为南瓜白粉病防治奠定理论基础。

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