4种乳菇属真菌的形态学与rDNA-ITS鉴定

田慧敏 李江

摘    要：为明确内蒙古赤峰地区常见有毒乳菇种类，准确、快速地识别有毒乳菇，将采集的4个乳菇属Lactarius真菌标本采用传统形态学分类方法进行鉴定，同时提取子实体DNA，使用真菌通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，用Blast对扩增产物纯化测序所得的序列进行比对，采用MEGA5.1软件构建系统发育树确定属和种。结果表明，2种方法鉴定结果一致，标本CFSZ10167为毛头乳菇[Lactarius torminosus （Schaeff.）Pers.]，标本CFSZ10216为绒边乳菇[Lactarius pubescens（Fr. ex Kronbh.）Fr.]，标本CFSZ13021为灰褐乳菇[Lactarius pyrogalus（Bull.）Fr.]，3种均为胃肠炎型毒菌，CFSZ10044为皱乳菇（Lactarius ruginosus   Romagn），为中国新记录种，主要特点是菌盖棕褐色、浅褐色，有绒质感，盖缘呈齿状，孢子球形具小刺，食毒不明。对4个种的形态学特征进行了详细描述，并附有生境图片和显微图像，研究结果为乳菇属物种鉴定和资源分布提供了重要补充，并为常见毒菌识别提供了理论依据。

关键词：乳菇属；毒菌；形态学；rDNA-ITS测序鉴定；系统发育树

中图分类号：Q939.5 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）01-056-08

Morphologal and rDNA-ITS identification of four fungi in Lactarius

TIAN Huimin， LI Jiang

（College of Chemical and Life Science， Chifeng University， Chifeng 024000， Inner Mongolia， China ）

Abstract： Four unkown poisonous mushrooms of Lactarius from the city of Chifeng in Inner Mongolia were collected and identified by morphology classification to identify the genera and species， the fungal DNA were extracted from the fruiting bodies， amplified by PCR using fungal universal primers ITS1/ITS4， the sequences obtained from purification and sequencing of amplification products were compared by blast， a phylogenetic tree was constructed using MEGA5.1 software to identify the genera and species as auxiliary mean. The results of the two methods are consistent， Specimen CFSZ 10167， CFSZ10216 and CFSZ13021 are  Lactarius torminosus（Schaeff.） Pers.， Lactarius pubescens（Fr. Ex Kronbh.）Fr. and Lactarius pyrogalus（Bull.） Fr. respectively， which are all gastroenteritis poisonous mushrooms， CFSZ10044 is Lactarius ruginosus Romagn， new to China. The main features include that the cap is tan or light brown， with a velvety texture and toothed margin， the spores are spherical with small spines， edible or poisonous unkown. The morphological characteristics of the four species were described in detail， and the habitat picture and micrograph were attached， and the result provided an important supplement to the species identification and resource distribution of Lactarius and a theoretical basis for the identification of common poisonous fungus.

Key words： Species of Lactarius; Poisonous fungi; Morphology; rDNA-ITS sequencing; Phylogenetic tree

毒菌亦称毒蕈、毒蘑菇，是指大型真菌的子实体食用后对人或畜禽产生中毒反应的物种，绝大部分属于伞菌，少部分为子囊菌[1]。有些毒菌与野生食用菌的外形特征极其相似，因此很容易混淆被误食而引起人畜中毒。据2014年统计，我国毒菌有435种[2]，分布在全国各地；每年都会发生毒菌引起的中毒事件，其中23个省份报道过此类事件，毒菌中毒是我国食物中毒致死事件的主因，致死率較高[3]。乳菇属（Lactarius）是常见的毒菌类群之一，该属的许多种真菌含有胃肠道毒素，引起肠胃炎反应[4-5]。而且有的种能富集重金属如铬、铜、铯、铅，易引起重金属中毒[6-7]。乳菇属主要的识别特征是子实体肉质，菌盖半球形，中央下凹、有时呈漏斗状，颜色多样，表面具绒毛或无，具同心环纹或无；菌褶新鲜受伤时往往有乳汁流出；担孢子在显微镜下无色至淡黄色，通常为球形至宽椭圆形，有小疣或小刺，常具有囊状体，许多种具有油囊体或乳汁管 [8]。菌盖、菌柄和菌褶的菌肉组织具球状细胞。该属真菌通常生于白桦林、蒙古栎、杨树林等阔叶林和油松、樟子松等针叶林内，与植物形成共生菌根，分布范围广，海拔低，是当地村民经常采集的一类真菌。乳菇属真菌的鉴定主要靠形态学特征，但是在地理环境、气候和营养条件的影响下，子实体颜色和大小都有一定的变化，给鉴定带来一定的困难。

近些年来基于核糖体DNA基因转录间隔区（rDNA-ITS）的聚合酶链式反应（PCR）扩增测序技术如内转录间隔区序列（ITS）、核糖体大亚基序列测序（nLSU）和核糖体大亚基序列测序（SSU）[9]、线粒体基因组、全基因组[10-12]等多种分子技术应用于乳菇属真菌鉴定和亲缘关系分析研究，大大提升了该科真菌的鉴定效率和准确度。然而，DNA证据并不总是与形态证据吻合，这又为食用菌和毒菌的识别和名称的使用带来了困扰和不便[13]。笔者在传统的形态鉴定基础上，利用rDNA-ITS对几种常见的乳菇属真菌进行鉴定，并附彩色图片，为毒菌的准确识别鉴定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

标本CFSZ10044、CFSZ10167和CFSZ10216于2013年8月12日采自内蒙古自治区赤峰市巴林右旗赛罕乌拉国家级自然保护区。CFSZ13021标本于2016年8月11日采集于内蒙古自治区赤峰市松山区城子乡盔甲山。所有标本拍摄生境照片后，测量子实体菌盖直径、菌柄长度和直径；观察新鲜子实体菌盖、菌柄颜色、附属物，菌褶颜色、乳汁颜色；采集、编号、晒干、装袋，带回实验室，经-80 ℃超低温冰箱（906GP-ULTS，塞默飞世尔科技有限公司）冷冻2周后，室温保存于赤峰学院化学与生命科学学院菌物标本室（CFSZ）。于2014年6月10日进行标本CFSZ10044、CFSZ10167和CFSZ10216的形态学鉴定，2015年2月15日进行分子鉴定。于2016年11月1日进行CFSZ13021标本的形态学鉴定，2017年4月27日进行分子鉴定。

1.2 形态鉴定

采用宏观特征、显微结构与化学试剂反应相结合的鉴定方法。颜色的判断主要依据采集时拍摄的彩色照片，选1～5个新鲜子实体，用游标卡尺测量其大小，观察颜色、形状、附属物等，菌褶颜色及变化、着生方式，菌肉颜色和气味等特征，显微观察在光学显微镜40倍镜下（奥特B203LED，爱迪泰克科技有限公司）完成，通常取小块菌褶、菌盖和菌柄表皮以4%～5%氢氧化钾作浮载剂制成徒手切片，担孢子以随机测量30个为准，菌丝、囊状体、担子等测量15～20个，测量长和宽范围，宽度测量以最宽处为准。孢子、菌丝、囊状体、担子等淀粉质反应是将梅尔泽试剂（Melzer’s reagent）加入到浮载剂中显色来判断，具体鉴定方法参照田慧敏等[14]的报道。

1.3 rDNA-ITS测序鉴定及系统发育树的构建

取子实体干品一小部分菌盖（含菌褶）用研钵研磨成粉末状，称取30 mg粉末，用DNA提取试剂盒（大连宝生物工程有限公司）提取基因组DNA。参照White等 [15]以ITS1/ITS4为正反向引物进行PCR扩增反应，将已测得的ITS序列提交至NCBI的GenBank（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）检索相似序列，用MEGA5.1软件中的Alignment程序对检索的相似序列和标本序列进行多重对位排比，并采用Analysis程序Kimura 2-parameter模式计算遗传距离，Bootstrap循环1000次，采用最大似然法构建系統发育树。

2 结果与分析

2.1 形态结构特征

2.1.1 毛头乳菇[Lactarius torminosus（Schaeff.）Pers.] 子实体中等大，菌盖直径3～6 cm，漏斗形，表面浅肉桂色，中央呈深褐色，具红棕色同心环纹，表面具平伏状绒毛，边缘内卷具粗毛或刺毛（图1-A～B）；菌肉白色，厚，伤不变色；菌褶乳白色或米色，干后米黄色，等长，较密，从盖缘发出短菌褶，伤后流出白色乳汁，后变褐色，味道辣；菌柄大小（5.2～8.4） cm×（1.2～1.5） cm，圆柱形，基部较细，中空，色同菌盖呈肉桂色，基部白色。

担孢子大小为（7.2～9.7） µm×（6.5～8.6） µm，无色，宽椭圆形，有小刺（图1-C）； 担子大小为（34.0～57.6） µm×（7.5～12.0） µm，棒状、具4个小梗、无色（图1-D）；褶侧囊体少，（52.0～70.0） µm×（9.0～12.0） µm，披针形，充满黄色内含物（图1-E）；乳汁管淡黄色（图1-F），菌盖表皮由杂乱菌丝组成，菌丝无色，顶端淡黄色，稍膨大，直径4.0～7.0 µm（图1-G）；菌柄表皮由排列整齐的菌丝和囊状细胞组成，菌丝直径5.0～9.6 µm，囊泡状细胞大小（18.0～33.6） µm×（12.0～32.0） µm，无色。

2.1.2 绒边乳菇（Lactarius pubescens Fr.） 子实体中等大，菌盖直径4.4～7.5 cm，起初半球形，后中部下凹呈漏斗状，边缘内卷且有絮状长绒毛，表面米白色或污白色，中间色深呈浅橙色至肉桂色，中间具稀疏的黄色绒毛（图2-A～B）；菌肉白色，厚，伤不变色；菌褶污白色，密，不等长，有从盖缘发出的短菌褶，乳汁白色，不变色；菌柄大小（2.7～4.0） cm×（1.5～2.0） cm，松软，圆柱形，污白色，有时具粉色色调。

担孢子大小为（6.0～8.1） µm×（4.4～6.5） µm，淡黄色，宽椭圆形表面具小疣（图2-C）； 担子大小为（28.8～43.4） µm×（7.2～9.6） µm，短棒状，无色（图2-D）； 褶侧囊体大小为（31.2～60.0） µm×（7.2～9.6） µm，披尖形，少，无色，有内含物（图2-E）。菌褶有胶状菌丝，直径4.3～5.8 µm，菌盖表皮由菌丝和囊状细胞组成，菌丝直径3.2～6.5 µm，囊状细胞大小为（19.6～35.0） µm×（12.0～20.0） µm（图2-F），菌柄表皮菌丝无色，顶端稍窄，直径9.6～16.8 µm。

2.1.3 灰褐乳菇[Lactarius pyrogalus（Bull.） Fr.] 子实体中等大，菌盖直径4.2～8.2 cm，扁半球形、中间下凹、边缘内卷、土黄褐色、黄棕色或棕褐色，表面光滑、湿时稍黏（图3-A～B）；菌褶离生，白色或米白色、干后色深呈棕色、乳汁白色；菌肉白色、干后米黄色、有辣味、无特殊气味；菌柄大小（2.5～6.0） cm×（0.6～1.4） cm，松软，圆柱形，污白色，伤变浅赭色。

担孢子大小（6.0～7.6） μm×（5.0～6.2） μm，近球形，表面有小刺和条状脊，淀粉质，在Melzer’s试剂中表现为蓝色（图3-C）；担子大小（28.8～46.4） μm×（7.2～9.6） µm，棒状，具4个小梗，无色，有黄色内含物（图3-D）；褶侧囊体大小（33.6～62.4） μm×（7.2～10.0） μm，梭形，有金黄色内含物（图1-E）；菌盖表皮菌丝薄壁，顶端钝圆，直径3.5～8.0 μm；菌柄表皮由排列整齐的菌丝组成，有内含物（图3-F）。

2.1.4 皱乳菇（Lactarius ruginosus Romagn） 子实体中等偏小，菌盖直径3.6～4.5 cm，扁半球形，后期平展，土黄色至棕灰色、边缘色浅、表面不黏、有短绒毛或呈绒质、表皮有皱纹，盖缘有齿状（图 4-A～B）；菌肉白色或淡黄色、无特殊气味；菌褶米白色、等长、密、干后边缘米黄色、有腥味；菌柄大小（6.0～8.0） cm×（0.7～1.2） cm，顶端较细、向下渐粗、疏松，后期中空，表面白色，光滑。

担孢子大小（6.5～8.8） μm×（4.8～7.2） μm，球形、具小刺、无色、长约2 μm、淀粉质（图4-C）；担子大小（40～60） μm×（10～15） μm，棒状、无色、有内含物（图4-D）；囊状体大小（33.6～62.4） μm×（7.2～10） μm，披尖形，有时顶端有小乳突，（图4-E）；菌盖表皮由无色菌丝和椭圆形细胞组成，菌丝顶端不膨大，有隔膜，顶端细胞大小（30.0～50.0） μm×（5.0～7.2） μm，下部细胞大小（20.0～35.0） μm×（15.0～20.0） μm（图4-F）；菌柄表皮由无色菌丝和椭圆形细胞组成，菌丝顶端不膨大，有隔膜，顶端细胞大小（30.0～50.0） μm×（5.0～7.2） μm，下部细胞大小（15.0～25.0） μm×（12.0～18.0） μm（图4-G）。

2.2 rDNA-ITS测序鉴定

2.2.1 测序样品比对结果 通过NCBI的GenBank数据库对4份标本的ITS序列进行BLAST检索，获得了与供试样品具有较高相似性的53个序列，其物种名称、登录号和来源见表1。

2.2.2 样品系统发育树 以毒红菇（R. emetica）为外群，对4个样本CFSZ10044、CFSZ10167、CFSZ10186和CFSZ13021的ITS序列及其相似序列（47个序列）构建系统发育树，结果表明，根据ITS序列聚类结果分为红菇属（Russula）和乳菇属（Lactarius），其中乳菇属分为两大支；第一分支为辣味乳菇亚属（Subg. Piperites）和忧郁乳菇亚属（Subg. Tristes）；第二分支为变红乳菇亚属（Subg. Plinthogalus）；CFSZ 10216和CFSZ10167位于第一分支的第一侧支，属于辣味乳菇亚属（Subg. Piperites）；CFSZ10216与绒边乳菇（L. pubescens）聚在一起；CFSZ10167与毛头乳菇（L. torminosus）聚在一起；CFSZ13021位于第一分支的第二侧支，属于忧郁乳菇亚属（Subg. Tristes），与暗褐乳菇（L. pyrogalus）聚在一起；CFSZ10044位于第二分支，属于变红乳菇亚属（Subg. Plinthogalus），与皱乳菇（L. ruginosus）聚在一起（图5）。

3 讨论与结论

毛头乳菇（L. torminosus）在外形上易与绒边乳菇（L. pubescens）混淆，二者相比，毛头乳菇孢子较大，为（7.2～10.3） µm×（6.5～8.6） µm，菌盖表面大多为肉桂色并具肉桂色同心轮纹[16-17]；绒边乳菇具明显较小的孢子（6.0～8.1） µm×（4.4～6.5） µm，且菌盖表面色为米白色或污白色。毛头乳菇含有胃肠道反应毒素和毒蝇碱等，中毒后会出现恶心、呕吐、腹泻等类似肠胃炎症状和抽搐、幻觉等神经精神性症状[1-2]。

分子鉴定中绒边乳菇与苏格兰乳菇（L. scoticus）和荒漠乳菇（L. tesquorum）相似度较高，但是本研究中标本菌盖颜色较深，且表面绒毛较长，尤其是菌盖边缘绒毛密度更大，而苏格兰乳菇菌盖表面绒毛很少，有似绒毛状纹理[18]，二者的区别需要细致的观察和研究，同时荒漠乳菇孢子较大（6～9 µm），外形不具以上特征[19]。绒边乳菇绒毛和菌褶中含有多种重金属和稀有金属，如铜、铬、钴，对人体可能不利[20]。

灰褐乳菇[Lactarius pyrogalus（Bull.）Fr.]为忧郁乳菇亚属（Subg. Tristes）忧郁组（Section Tristes），与暗褐乳菇（L. fuliginosus）和皺盖乳菇（L. corrugis）外形特征相似，但是暗褐乳菇菌盖表面具放射状皱纹，且有绒毛，孢子略大（7.4～8.3） μm×（6.3～7.5） μm[17]；皱盖乳菇菌盖颜色深，栗褐色，表面不黏，孢子较大（6.9～9.1） μm×（6.4～7.3） μm[16]。而灰褐乳菇表面不具绒毛、光滑、湿时黏、黄棕色或浅棕褐色，孢子较小（6.0～8.5） μm×（5.0～6.2） μm[21-22]，与以上两种形态上有明显区别。灰褐乳菇有轻微毒性，中毒后会出现恶心、呕吐、腹泻等类似肠胃炎症状，仅分布于吉林和内蒙古两地[2，17]。

皱乳菇（Lactarius ruginosus Romagn.）最明显的特征是菌盖棕褐色至浅褐色，有绒质感，盖缘呈齿状，孢子球形具小刺[16-18]。与该种相似的变红乳菇亚属（Subg. Plinthogalus）的种有翅孢乳菇（Lactarius pterosporus）、暗褐乳菇（Lactarius fuliginosus）、Lactarius azonites和罗迈尼乳菇（Lactarius romagnesii）等，但是都与该种有明显区别，如翅孢乳菇菌盖表面往往皱缩，边缘颜色较深，孢子的脊呈条斑形，似具翅，刺长2.5 μm，孢子也略小（7～8） μm×（5～7） µm[18-19]；暗褐乳菇菌盖表面光滑，肉粉色，或粉红色，或浅咖啡色，菌柄色深，孢子较大平均10 µm×8 µm，具明显的脊[17，22]；L. azonites菌盖浅黄色至烟灰色至酒红色，孢子明显偏大（8.0～9.0） µm×（7.5～8.5） µm，具完整的脊，罗迈尼乳菇孢子大小（7.3～9.8） µm×（6.3～8.3） µm，具网状脊，菌柄圆柱形或向下渐变细，具纵沟纹，菌肉温和，微苦[23-24]，特征与该种不同；分子证据显示本研究中的标本CFSZ10044与白灰乳菇（L. albidocinereus）亲缘关系较近，但是白灰乳菇菌盖颜色为灰白色或灰褐色，有时褪为白色，而该标本为赭色，区别很明显，该种在我国尚未发现分布记录，为中国新记录种。皱乳菇属于阴沉乳菇亚属Subg. Plinthogalus，该亚属的种在我国分布较少，如黑乳菇（L. lignyotus）、暗褐乳菇和沥青色乳菇，因此，应当谨慎食用。

笔者采用形态学与ITS测序相结合的方法对乳菇属真菌进行鉴定，结果可靠，方法简便、成本低廉，该法也可用于其他属大型真菌的准确鉴定和推广使用。为当地乳菇类有毒真菌的识别提供方便，为菌物资源的鉴定及安全开发提供依据。但是研究中存在很多不足之处，首先，笔者的研究仅对部分地区有毒乳菇分布进行调查，范围不够广泛，不能全面代表赤峰地区有毒乳菇种类，下一步应该扩大调查范围，在分子鉴定时进一步采用多种基因标记技术相结合作为辅助手段，以期鉴定更加准确；其次，由于条件所限和笔者水平有限，对显微结构如孢子的脊线和小疣等特征没有清晰的展示，后期研究过程中根据实际情况进行手绘或电镜拍照或染色处理；再次，显微结构的数据来源于干标本，制作徒手切片时孢子、囊状体、担子等结构遇水会膨胀，与实际情况会有误差，笔者在本研究中采用4%～5%KOH做载浮剂，较大程度地减少了误差。国内较多文献都采用5% KOH和10% KOH两种载浮剂用于红菇科真菌的研究。Wang等[25]采用5%KOH作为乳菇属载浮剂，而李国杰等[26]将5% KOH和10% KOH两种配合使用，大部分标本采用5%KOH载浮剂，对5% KOH溶液恢复效果不佳的极少数标本改用 10%KOH 处理，并将装片在酒精灯上略微加热，以加速并改善显微结构恢复效果。因此，本研究中标本采集时间与形态学鉴定时间间隔短，采用5% KOH载浮剂相对合理。

乳菇属真菌种类多、分类复杂，形态、颜色、大小较为相似，如果没有长期采集和分类鉴定经验很难区分，尤其是该属有些毒菌具有致命毒素，不少种也含有肠胃炎毒素，同时有些毒种往往与食用菌混生，如白杨乳菇（L. controversus）、绒白乳菇（L. vellereus）、红汁乳菇（L. hatsudake）等食用野生菌与毛头乳菇、绒边乳菇等毒菌经常生于海拔较低的杨树林、油松林，而这些地方都是村民采食野味的必经之地，被采食的概率极高，存在潜在的危险。建议当地有关部门采取建立当地名录、印制毒菌图册、制作毒菌展板等方式，加大宣传力度，增强群众的防范意识和对毒菌的识别能力。

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