大白菜蜡质缺失突变体YW71的遗传及序列变异分析

杨双娟 唐昊 赵艳艳 魏小春 王志勇 苏贺楠 张文静 李林 王坐京 原玉香 张晓伟

摘    要：以大白菜蜡质突变体YW71为对象，研究其亮绿无蜡粉性状的遗传规律和调控基因。通过遗传分析，表明YW71中的亮绿无蜡粉性状由隐性单基因控制。通过等位基因互补实验证明YW71的亮绿性状是BrWAX2等位突变引起的。序列分析表明，在YW71中BrWAX2基因在第3个外显子末端发生了39 bp的缺失，进而引起转录水平的可变剪切和翻译水平的提前终止。表达模式分析表明，BrWAX2基因在YW71茎和叶中表达量显著下降。此外，研究针对39 bp的变异开发并验证了共显性标记BrWAX2-InDel1。研究结果丰富了白菜类蔬菜蜡质突变遗传资源，将为亮绿无蜡粉品种的分子育种提供理论指导和技术支持。

关键词：大白菜；亮绿突变体；等位基因互补实验；序列变异分析

中图分类号：S634.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）01-032-07

Inheritance and sequence variation analysis of a wax-less mutant YW71 in Chinese cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）

YANG Shuangjuan1， TANG Hao1， 2， ZHAO Yanyan1， WEI Xiaochun1， WANG Zhiyong1， SU Henan1， ZHANG Wenjing1， LI Lin1， WANG Zuojing1， YUAN Yuxiang1， ZHANG Xiaowei1

（1. Institute of Vegetables， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. College of  Horticulture and Landscape Architecture， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China）

Abstract： In this study， we identified a wax-less Chinese cabbage （Brassica rapa） mutant YW71， the inheritance and the controlling gene for the glossy trait were studied extensively. Genetic analysis indicated that the glossy trait in YW71 was controlled by a single recessive locus. Allelic complementary experiment showed that the glossy trait in YW71 was caused by mutation of the gene BrWAX2. Sequence analysis revealed that a 39 bp deletion was identified at the end of the third exon of BrWAX2， resulting in alternative splicing at the transcription level and finally leading to a premature stop codon at the translation level. Expression analysis showed that BrWAX2 was significantly down-regulated in stems and leaves of glossy YW71. Furthermore， a co-dominant marker BrWAX2-InDel was developed and validated. Overall， these results enrich the genetic resources of glossy mutants and provide applicable markers for marker-assisted selection （MAS）-based breeding of Chinese cabbage， which has pivotal significance in theory and practice.

Key words： Chinese cabbage; Glossy mutant; Allelic complementary experiment; Sequence variation analysis

植物表面的蠟质也称蜡粉，是覆盖在植物表皮细胞外的一层由亲脂性化合物构成的疏水层[1-2]。蜡粉的主要作用是减少非气孔的水分散失、增强植株对生物胁迫和非生物胁迫的抗性等。此外，蜡质还影响植物的生长发育，蜡质缺失相关基因的突变会引起器官融合和育性降低[3-4]。白菜类作物（Brassica rapa L.）属于十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica），包括大白菜（B. rapa subsp. pekinensis）、小白菜（B. rapa subsp. chinensis）、芜菁（B. rapa subsp. rapifera）、菜心（B. campestris L. chinensis var. utilis Tsen et Lee）等多个亚种和变种，拥有共同的基因组（A基因组），相互之间杂交可以结实，没有生殖隔离，在大白菜中鉴定的优异基因可以通过杂交并回交的方式转移到菜心和小白菜中[5]。白菜类作物中的菜心和薹菜等以鲜嫩的茎和叶为食用器官，其叶片和茎表皮蜡质性状是一个重要商品性状。蜡质缺失蔬菜的叶片和茎部表皮覆盖蜡质极少，颜色亮绿，有光泽，商品性好，食用品质佳，感官上更鲜嫩，更受消费者喜爱[6-7]。但是白菜类蔬菜的蜡质性状只有在抽薹开花期才能表现出来，在选育亮绿无蜡粉材料过程中费时费力，极大地延缓了育种进程。因此，鉴定新的亮绿无蜡粉基因，并开发实用的分子标记，进而利用分子标记辅助筛选对加快亮绿无蜡粉品种的育种速度具有重要意义。

目前，白菜类蔬菜中克隆了4个亮绿无蜡粉基因。Zhang等[8]以亮绿无蜡粉08A235-2为亲本，克隆了BrWAX1基因，该基因编码BAHD酰基转移酶，与拟南芥CER2基因同源。笔者研究团队前期以亮绿无蜡粉材料Y1211-1为亲本，克隆了BrWAX2基因，该基因编码醛脱羧酶，与拟南芥CER1基因同源[9]。研究表明，Y1211-1材料完全缺失了BrWAX2基因，阻碍了C30醛向C29烷烃的转化，导致了烷烃物质的含量降低，并最终表现出亮绿无蜡粉表型。此外，笔者研究团队以亮绿无蜡粉材料SD369为亲本，克隆了BrWAX3基因，该基因编码酮脂酰CoA合酶，是AtCER60的同源基因[10]。最近，Li等[11]以亮绿材料HN19-G为亲本，通过图位克隆方式分离了一个新的蜡质基因Brcer2，该基因编码BAHD酰基转移酶，影响C28脂肪酸的延伸。

前人分离蜡质基因大多通过正向遗传学的图位克隆方式获得目的基因，并解析蜡质突变基因的序列变异方式，但是近年来涌现出很多重复性研究工作，例如Liu等[12]于2017报道鉴定了甘蓝的一个蜡质基因Cgl2，该基因在甘蓝基因组中对应基因Bol013612，是拟南芥CER4的同源基因，该基因在突变材料LD10GL中发生了一个SNP的突变导致了功能缺失；而相同的作者于2018年又报道鉴定了一个蜡质基因BoWax1，该基因同样是拟南芥CER4的同源基因，在基因组上对应相同的基因Bol013612，只不过该基因在新的突变体材料HUAYOU2中发生了2 bp的缺失[13]，与之前的序列变异方式不同而已。笔者认为这种相同基因的不同等位变异方式的解析，可以先通过突变体材料的杂交确定是否是等位基因，如果是等位基因，直接对目的基因进行测序进而解析其序列变异方式，如果不是等位基因，再进行图位克隆进行目的基因分离，如此可以避免图位克隆的重复性工作，提高基因利用效率。

笔者以蜡质突变体YW71为研究材料，通过构建遗传群体分析了YW71中亮绿无蜡粉性状的遗传规律，通过等位基因检测方式判断YW71与已知蜡质突变体的关系，克隆了YW71中的蜡质基因，开发了基因内的分子标记，以期为白菜类蔬菜蜡质合成的分子机制解析和亮绿无蜡粉材料的分子辅助育种提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料与遗传分析

笔者的试验选用小孢子培养获得的双单倍体DH系YW71、R16、YW81、Y1211-1和SD369为供试材料，材料均由河南省农业科学院蔬菜研究所提供。YW71为亮绿无蜡粉材料，R16为正常的有蜡粉材料，以YW71和R16为亲本，杂交获得F1，进而F1自交获得F2。2022年1月5日将YW71、R16以及F1和F2群体种植于河南省农业科学院蔬菜研究所原阳试验田，田间统一管理，待所有材料抽薹后调查每个植株花茎、叶片上有无蜡粉，根据F2的有蜡粉植株和亮绿无蜡粉植株的分离比例进行遗传规律分析。

YW81、Y1211-1和SD369均为亮绿无蜡粉材料，YW81的亮绿表型是由BrWAX1基因突变引起的[8]，Y1211-1的亮绿表型是由BrWAX2基因完全缺失造成的[9]，SD369的亮绿表型是由BrWAX3基因第一个外显子的5567 bp的插入突变引起的[10]。笔者的研究将YW71分別与YW81、Y1211-1和SD369杂交获得F1，进而观察F1植株花茎和叶片表面蜡粉的有无。如果两个亮绿材料的F1表现为有蜡粉表型，则表明两个亮绿材料携带的蜡质基因不是等位基因，在基因组上位于不同的位置；如果两个亮绿材料的F1表现为亮绿无蜡粉表型，则表明两个亮绿材料携带的蜡质基因是同一个基因，即在基因组上位于同一基因座位。

1.2 基因组DNA提取和目的基因克隆

采集供试材料的新鲜叶片，采用CTAB法[14]提取所需材料的基因组DNA，用NanoDrop One（Thermo Scientific公司）和1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和浓度。

采用BrWAX2全长引物BrWAX2-g1（表1）[9]扩增YW71的gDNA全长和CDS全长序列。扩增所用PCR体系为50 μL：3 μL DNA模板（100 ng·μL-1），25 μL Phanta Flash Master Mix（2×）（诺唯赞生物科技股份有限公司），上下游引物各3 μL，16 μL ddH2O。PCR扩增程序为第一阶段98 ℃变性30 s；第二阶段98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；第三个阶段72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物送公司（上海铂尚生物科技有限公司）利用F和R引物进行双向Sanger测序，进而获得每份材料的基因序列。获得序列利用DNAMAN8.0软件进行多重序列比对。

1.3 RNA提取和qPCR定量分析

采集YW71和R16抽薹后的叶片和茎表皮，置于液氮中速冻。采用TaKaRa公司RNAiso Plus试剂盒提取总RNA，使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Kit（全式金生物技术有限公司）将YW71和R16的RNA反转录成cDNA。

以BrGAPDH作为内参基因[15-16]，用引物BrWAX2-Qua1（表1）[9]进行表达量分析。定量分析所用试剂为TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM II，PCR反应在Roche LightCycler 480II上进行。目的基因的相对表达量采用2-ΔΔCt方法计算。表达量显著性分析和作图利用GraphPad Prisim完成。

1.4 常规PCR扩增和检测

PCR 反应体系总体积为 20 μL，其中包括 3 μL 50 ng ·μL-1 模板 DNA，上、下游引物（10 μmol ·L-1）各1 μL，10 μL 3G Taq Master Mix（诺唯赞生物科技股份有限公司），ddH2O 5 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34个循环；最后72 ℃延伸5 min。

PCR产物使用9%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

2 结果与分析

2.1 材料YW71中亮绿无蜡粉性状由隐性单基因BrWAX2控制

YW71的茎和叶表现为亮绿无蜡粉（图1）， R16的茎和叶表面被覆蜡粉（图1），两个亲本杂交得到的F1表现为有蜡粉表型，F2 群体中有蜡粉植株 102 株，无蜡粉植株40株，经卡平方测验符合3∶1的分离比例（χ2 = 0.76 < χ20.05 = 3.84，p < 0.05）。综上，遗传分析表明YW71中亮绿无蜡粉性状由1对隐性核基因控制。

YW81、Y1211-1和SD369均为亮绿无蜡粉材料，携带的蜡质基因分别是BrWAX1、BrWAX2和BrWAX3。为了明确YW71携带的蜡质基因是否与上述3份亮绿无蜡粉材料携带的蜡质基因一样，将YW71和这3份材料分别杂交获得F1。结果表明，YW71和YW81杂交得到的F1植株表现为正常有蜡粉表型，（YW71×SD369）F1也表现为正常有蜡粉表型，但是YW71和Y1211-1的杂交F1植株表现为亮绿无蜡粉表型（图1），表明YW71和Y1211-1攜带蜡质基因相同，均是由BrWAX2基因突变引起的亮绿表型。

2.2 YW71中亮绿无蜡粉性状由BrWAX2基因39 bp缺失引起

为了探明亮绿材料YW71中BrWAX2基因是如何变异导致的亮绿无蜡粉表型，笔者利用全长引物BrWAX2-g1扩增亮绿材料YW71的全长DNA和CDS序列（图2），序列分析表明在DNA水平上，与正常有蜡粉材料R16相比，亮绿材料YW71中BrWAX2基因在790 bp处发生了39 bp的缺失，但是在cDNA水平上，R16的CDS全长为1887 bp，YW71的CDS全长序列为1436 bp，YW71的CDS全长序列比R16减少了451 bp（图3-A）。笔者在第4个外显子末端设计了2个反向互补引物BrWAX2-P2R和BrWAX2-P3F，分别与BrWAX2-g1F和BrWAX2-g1R配对组成分段引物BrWAX2-P2和BrWAX2-P3，以YW71和R16的cDNA为模板进行扩增，结果表明，BrWAX2-P2在R16中的扩增产物大小为714 bp，在YW71中的扩增产物大小为263 bp （图3-B），片段大小差异为451 bp，而BrWAX2-P3在R16和YW71中的扩增大小一致，均为1195 bp，由此也进一证明，BrWAX2基因在亮绿材料YW71中缺失了451 bp的CDS序列。将2份材料BrWAX2基因的DNA和CDS序列进行比对分析，发现亮绿无蜡粉材料YW71中39 bp的缺失发生在第3个外显子末端4 bp和第3个内含子前端35 bp的邻接处，该39 bp的缺失引起了可变剪切，具体表现为第2和第3外显子的缺失（图3-C），最终导致翻译蛋白的提前终止和蛋白功能缺失（图3-D）。

2.3 YW71中BrWAX2基因表达量显著下降

前期研究表明，蜡质基因BrWAX2在茎、叶、萼片、花瓣等地上组织中表达量均较高[9]，为分析亮绿无蜡粉材料YW71中BrWAX2基因的表达情况，研究提取了YW71和R16茎和叶的RNA。以BrGAPDH作为内参基因，用引物BrWAX2-Qua1（表1）检测BrWAX2基因在YW71中的相对表达量。结果表明，无论是在有蜡粉材料R16还是在亮绿材料YW71中，BrWAX2基因在叶片中的表达量均高于在茎中的表达量（图4）。BrWAX2基因在材料R16茎表皮的表达量是YW71茎表皮中的3.2倍（图4），表达水平呈极显著差异；在R16叶片中的表达量是YW71叶片中的2.2倍（图4），表达水平也呈极显著差异。

综上，BrWAX2基因在亮绿无蜡粉材料YW71中的表达量显著降低，与蜡粉表型数据是一致的，从表达水平证明了YW71亮绿无蜡粉表型与BrWAX2基因的变异相关。

2.4 突变位点的标记开发和验证

为了进一步验证YW71亮绿无蜡粉表型是否是由BrWAX2基因突变引起的，笔者针对YW71中该基因39 bp的缺失设计了一个InDel标记BrWAX2-InDel1（表1），在有蜡粉材料R16中扩增条带为255 bp，在亮绿材料YW71中条带大小为216 bp。将此标记在（YW71×R16）F2群体中进行验证，结果表明，在检测的142个F2单株中，102株有蜡粉单株的基因型有2种带型，其中65株的带型为杂合带型，37株的带型与R16一致（图5），而40株亮绿无蜡粉单株的基因型均和YW71一致，均扩增出216 bp的条带（图5）。

综上，标记BrWAX2-InDel1检测的基因型和有无蜡粉表型数据完全一致，表明YW71亮绿无蜡粉表型是由BrWAX2基因突变引起的。

3 讨论与结论

笔者发现了一个新的蜡质突变体YW71，通过多个证据证明了YW71的亮绿无蜡粉表型是由BrWAX2基因等位突变引起的。其一，通过突变体等位基因测试实验证明YW71与Y1211-1突变体为等位基因，均是由BrWAX2基因突变引起的；其二，序列分析表明BrWAX2基因在YW71中发生了39 bp的缺失，该变异发生在第3个外显子末端，引起了可变剪切和翻译的提前终止，最终导致蛋白功能缺失；其三，表达量分析表明，BrWAX2基因在亮绿无蜡粉材料YW71的茎和叶中的表达量均显著下降；其四，基于39 bp缺失变异设计的标记BrWAX2-InDel1在F2群体中的基因型与有、无蜡粉表型完全一致。综上，材料YW71的亮绿无蜡粉表型是由BrWAX2基因第3个外显子末端39 bp的缺失引起的。

植物蜡质的合成包括三个阶段：首先是C16/C18脂肪酸在质体中的从头合成；然后是在内质网上合成超长链饱和脂肪酸（VLCFA）；最后是VLCFAs通过醇合成途径（Alcohol-forming pathway）和烷烃合成途径（Alkane-forming pathway）合成表皮蜡质成分[2-3]。烷烃代谢途径的主要产物有烷烃、醛、酮、次级醇等，这些蜡质成分大约占拟南芥蜡质总量的80%左右；醇合成途径的主要产物是初级醇和蜡酯，它们大约占蜡质总含量的20%左右[17]。CER1是烷烃合成途径的主要基因，催化C30醛脱羧基转变为C29烷烃，CER1基因的突变会引起C29烷烃的含量下降，以及C30醛含量的上升[9，18]。在白菜中，笔者研究团队发现突变体Y1211-1的亮绿无蜡粉表型是由BrWAX2（CER1）基因的完全缺失引起的[9]。Liu等[19]在一个白菜EMS突变体中发现CER1基因在第4个外显子的一个SNP变异导致了亮绿无蜡粉表型。本研究通过等位基因杂交测验方式快速证明了新发现的蜡质突变体YW71和已知突变体Y1211-1携带的蜡质突变基因为等位基因，避免了图位克隆等分子实验，大大节约了实验成本以及人力物力投入。

综上所述，笔者研究发现YW71的亮绿表型是由CER1基因在第3个外显子末端的39 bp的缺失变异导致的，丰富了BrWAX2（CER1）基因的遗传资源和变异形式。此外，笔者研究开发的基因特异标记BrWAX2-InDel1可以用于亮绿无蜡粉材料和品种的分子标记辅助选择，具有重要的应用价值。

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