基于非靶向代谢组学的平菇子实体发育过程中菌丝体差异代谢物分析

刘芹 黄保 胡素娟 牛森园 吴杰 周奥硕 孔维丽

摘    要：為了解平菇生长发育过程中子实体形成的代谢物基础，采用超高效液相色谱-电喷雾串联四级杆质谱（UPLC-ESI-MS/MS）技术结合多变量统计分析方法对发菌完成期（MM）、原基期（MP）及子实体分化期（MF）的平菇菌丝体进行代谢组学分析。结果表明，主成分（PCA）模型分析结果显示3个时期平菇菌丝体中的代谢产物具有明显差异。通过正交偏最小二乘判别分析（OPLS‐DA），以VIP（varible importance in the projection）>1和差异倍数值（fold change）≥ 2或 ≤ 0.5为条件对MM vs MP、MM vs MF和MP vs MF中的差异代谢物进行比较分析，分别获得139个、147个和67个差异代谢物，变化倍数最大的物质包括氨基酸及其衍生物、脂质、生物碱、有机酸等，说明这些差异代谢物对平菇子实体发育具有重要影响。KEGG分析表明，苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、嘌呤代谢等20条代谢通路表现活跃。在子实体发育过程中，脂质、有机酸、核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物之间明显相关。以上研究结果为平菇子实体发育机制和标准化栽培提供了理论依据。

关键词：平菇；代谢组学；菌丝体；差异代谢物；子实体发育

中图分类号：S646.1+4 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）01-045-11

Analysis of differential metabolites during fruiting body development of Pleurotus ostreatus based on untargeted metabolomics

LIU Qin1，HUANG Bao1，HU Sujuan1，NIU Senyuan2，WU Jie3，ZHOU Aoshuo4，KONG Weili1

（1. Key Laboratory of Evaluation and Utilization of Germplasm Resources of Edible Fungi in Huang-Huai-Hai Region， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Institute of Edible Fungi， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. College of Life Science and Technology， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China; 3. College of Life Sciences， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China; 4. Zhengzhou Financial School， Zhengzhou 450007， Henan， China）

Abstract： In order to understand the metabolite basis of fruiting body formation during the growth and development of Pleurotus ostreatus， ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry interfaced with electro-spray ionization （UPLC-ESI-MS/MS） combined with multivariate statistical methods was used to analyze the differences of intracellular metabolites in mycelia of P. ostreatus at the spawning completion stage， primordium stage and fruiting body differentiation stage. The results showed that principal component （PCA） model revealed significant differences （p<0.05） among metabolites in mycelia of P. ostreatus at the three periods. Through orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS‐DA）， 139， 147 and 67 differential metabolites were screened and identified in MM vs MP， MM vs MF and MP vs MF under the conditions of VIP （varible importance in the projection） > 1 and fold change ≥ 2 or ≤ 0.5. Amino acids and derivatives， lipids， alkaloids and organic acids were substances with the maximum fold change values， which indicated that these differential metabolites played important roles in the fruiting body development. KEGG analysis showed that phenylalanine metabolism， tryptophan metabolism， purine metabolism and other metabolic pathways were active. During the growth and development of P. ostreatus， the contents of lipids， organic acids， nucleotides and their derivatives， and amino acids and their derivatives were significantly correlated. The results of this study provided theoretical basis for the mechanism of fruiting body development and standardized cultivation of P. ostreatus.

Key words： Pleurotus ostreatus; Metabonomics; Mycelia; Differential metabolites; Fruiting body development

食用菌因具有丰富的营养、独特的风味以及广泛的生物学活性而被认定为“新一代食物”[1]。食用菌具有热量低、膳食纤维和蛋白质含量高的優点，并且还含有各年龄段人群所需要的氨基酸、矿物质和维生素等，而这些通常是植物来源食品中所缺乏的[2]。此外，食用菌还具有调节免疫力、抗炎、抗肿瘤、抗病毒和抗氧化等功能[3]。因此，食用菌常被用作营养丰富的食品、补充剂、保健品以及医药制品等的原料[4]。中国是食用菌生产大国。目前，我国可栽培食用菌大约有967种，几乎占世界可栽培食用菌种类的50%，其中已实现商业化栽培的有60多种[5]。2021年我国食用菌年产量达到4 133.94万t，比2020年增长了1.79%，总产值达到3 475.63亿元，比2020年增长0.29%[6]。食用菌已经是我国继粮、菜、果、油之后的第五大农作物[5]。

食用菌子实体的形成与自身发育的分子机制密切相关，对食用菌的产量和品质有重要影响[7]。食用菌在生长发育过程中，菌丝通过分解培养料中的木质纤维素、蛋白质、多糖等高分子物质，产生大量的低分子代谢物以满足子实体所需[8]。据报道，有10万多种特有代谢物如多糖、黄酮、脂质、萜类、酚类等广泛存在于各种食用菌菌丝体中，作为食用菌营养来源或生长发育调控物质[9]。研究表明，谷氨酸在亚洲兰茂牛肝菌原基发育中起重要调控作用[10]。羊肚菌营养生长过程中，脂肪酰基类物质在羊肚菌菌丝体内的主要功能为能量贮存，胺类物质参与羊肚菌生长发育、子实体成熟，吡啶类物质可提高羊肚菌的抗病能力[9]。L-精氨酸可能参与牛樟芝的解毒、保肝作用[11]。因而，有必要对食用菌菌丝生长发育过程中的代谢产物进行深入研究。

平菇是我国第三大食用菌栽培种类，具有经济价值高、栽培技术简单、栽培原料来源广泛的优点[12]。目前我国平菇栽培主要是以玉米芯、棉籽壳、秸秆等为主料制成的栽培袋对平菇生长进行营养供应[8]。栽培袋营养供应不足会导致平菇出菇率低、子实体发育受限；营养供应过剩可能会导致资源浪费或增加其他杂菌的污染概率。因此，明确平菇菌丝生长对养分的需求规律，了解各个代谢物在平菇生长发育中的作用，有助于精准化控制平菇所需栽培料，为找到平菇适宜栽培代料或混配配方提供理论依据。

代谢组学是对一个生物系统的所有代谢物进行定性和定量的全面分析，并能揭示生物系统的一门科学[9]。代谢组学的出现使人们更好地理解作物在受到刺激或生长发育过程中代谢过程的变化，通过标志性代谢的挖掘与验证，可以从代谢物角度找到调节作物生长发育的重要调控剂[13-14]。因此，笔者通过非靶向代谢组学对发菌完成期、原基期及子实体分化期的平菇菌丝体进行代谢组学分析，以明确平菇生长发育过程中子实体形成的代谢物基础，探索平菇子实体发育机制，为平菇栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

豫黑平16（品种权号：CNA20191002079），保藏于河南省食用菌种质资源库。

1.2 样品收集

平菇栽培试验于2022年2－5月在河南现代农业试验示范基地进行。栽培配方为棉籽壳88%、10%麸皮、石灰2%。参考Du等[13]的方法，收集培养30 d（发菌完成期，MM）、40 d（原基期，MP）和42 d（子实体分化期，MF）的菌丝体（图1），每9个栽培袋收集的样品置于1个无菌离心管中，作为1个试验重复，共设置3次重复。样品用液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.3 样品处理

将冷冻干燥的样品置于2 mL研磨管中，加入2颗钢珠，研磨机（MM-400，Retsch，德国）30 Hz研磨1.5 min。称取100 mg冻干粉加入1.2 mL 70%甲醇（-20 ℃预冷，色谱级），涡旋振荡，样本置于4 ℃冰箱过夜。离心（4 ℃，12 000 r‧min-1，10 min）收集上清液，经0.22 μm膜过滤后用于UPLC-ESI-MS/MS分析。

1.4 UPLC分析

采用装备有电喷雾离子源3重4极杆线性离子阱（electrospray ionization-triple quadrupole-linear ion trap，ESI-Q TRAP）（Nexera X2，Shimazdu，日本）的超高效液相色谱-电喷雾离子源串联质谱仪（ultra performance liquid chromatography‐electrospray ionization-mass spectrometry/mass spectrometry，UPLC-ESI-MS/MS）对样品进行分析。色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）（安捷伦科技有限公司，美国），柱温40 ℃，进样量4 μL。流动相为0.1%甲酸的水（溶剂A）和乙腈（溶剂B）。流动相梯度：0～9.0 min，95%～5% A；9.0～10.1 min，5% A；10.1～11.1 min，5%～95% A；11.1～14.0 min，95% A，流速0.3 mL·min-1。

1.5 ESI-Q TRAP-MS/MS分析

AB4500 Q TRAP UPLC-MS/MS系统与ESI Turbo离子喷雾接口耦合，在负离子和正离子模式下由Analyst 1.6.3软件（AB Sciex）控制。电喷雾离子源，涡轮喷雾温度550 ℃，离子喷雾电压为-4500 V（负离子模式）和5500 V（正离子模式）。离子源气体I、II（GSI、GSII）和幕气（curtain gas，CUR）的压力分别为50、60和6.9 kPa（25 psi）；碰撞激活解离（collision-activated dissociation，CAD）设置为高。以氮气为中间碰撞气体，采用多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）进行3重4极扫描试验。对单个多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）跃迁进行了进一步的聚类势（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）优化。根据各时期代谢物的洗脱情况，检测出一组特定的MRM离子对。

1.6 数据分析

基于MVDB（metware database）和代谢物信息公共数据库，根据二级谱信息对代谢物进行定性，并利用3重4极杆质谱的MRM模式进行定量。得到的质谱数据采用Analyst 1.6.3软件处理，色谱峰的积分和校正采用MultiaQuant软件[15]。数据分析采用SPSS 22.0软件，代谢物组间显著性差异分析采用Student’s t-test方法。皮尔逊相关系数（Pearson’s correlation coefficient，PCC）作為生物学重复相关性的评估指标，利用R 3.1.2软件的内置cor函数进行计算。采用R 3.1.2软件进行无监督主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）。分层聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和PCC分析结果可视化均采用pheatmap包。根据OPLS-DA获得的变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）评分，将VIP≥1和差异倍数值≥2或≤0.5的代谢物定义为差异代谢物，同时将得到的相应差异代谢物提交到KEGG数据库网站进行注释，获得代谢物参与的代谢途径。差异代谢物相关性分析采用R 3.1.2软件，可视化分析采用Gephi 0.9.2软件。

2 结果与分析

2.1 数量质量评估

检验测序结果的可靠性以及样本选择的合理性主要通过样品的重复相关性来判断。样品间的生物学重复采取相关性分析来评估，组内样品相对组间样品的相关系数越高，说明获得的差异代谢物越可靠。在笔者的研究中，样品间的生物学重复的相关性采用皮尔逊相关系数（Pearson’s correlation coefficient）r作为评估指标。由图2可知，MM、MP和MF 3组样品间的相关系数均接近1，说明3组样品间的重复性好，可以用作后续分析。

由图3可知，对获得的代谢物进行聚类热图分析，根据平菇子实体发育过程中菌丝体中代谢物的差异，MM、MP和MF组样本被明显分为3类，但是MP和MF距离较近，说明两者的代谢轮廓更为相似。

2.2 主成分分析和正交偏最小二乘法判别分析

采用无监督主成分分析（Principal component analysis，PCA）的方法来评估所有样本之间的总体分布和整个分析过程的稳定性。由图4可知，3组样品被明显区分开，PC1解释了总变量的60.29%，PC2解释了总变量的18.47%，PC3解释了总变量的7.92%。这说明3组样品间的代谢产物具有明显的差异。所有质控（mix）样品聚类在一起，具有良好的分析稳定性和试验重现性。

进一步采用有监督的判别分析统计方法正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）对数据进行分析，以更充分地提取3组样品间的差异信息，筛选差异代谢物（图5）。一般来说，R2Y和Q2越接近1，建立的模型稳定性和可信度越高。MM vs MP、MM vs MF、MP vs MF的R2Y均是1，Q2分别为0.98、0.97和0.95，均比较接近1，说明建立的OPLS⁃DA模型具有稳定性和可靠性，能够反映样本的真实情况。

2.3 差异代谢物筛选及分析

基于OPLS-DA结果，以变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）≥ 1和差异倍数值（fold change）≥ 2或≤ 0.5相结合的方法来筛选差异代谢物。MM vs MP筛选出139个差异代谢物，其中上调40个，下调99个；MM vs MF筛选出差异代谢物147个，其中上调63个，下调84个；MP vs MF筛选出67个差异代谢物，其中上调48个，下调19个（图6）。这说明由菌丝期到原基期，菌丝体中的大部分差异代谢物下调，而由原基期到子实体分化期，菌丝体中的大部分差异代谢物上调。差异代谢物类型主要包括：生物碱、核苷酸及其衍生物、有机酸、酚酸类、氨基酸及其衍生物、脂质以及其他类化合物。

根据代谢物的差异倍数大小取对数进行排序，选取上调和下调倍数最大的前10个差异代谢物进行分类与统计。由图7所示，较为活跃的物质包括氨基酸及其衍生物、脂质、生物碱、有机酸等。MM vs MP中上调的物质包括3，4'-二羟基-3'-甲氧基苯戊酸（3，4'-dihydroxy-3'-methoxybenzenepentanoic acid）、鸟苷3'，5'-环单磷酸（guanosine 3'，5'-cyclic monophosphate）、N-γ-乙酰基-N-2-甲酰基-5-甲氧基犬尿氨酸（N-γ-acetyl-N-2-formyl-5-methoxykynurenamine）、丙酮酸（pyruvic acid）、延胡索酸（fumaric acid）等；下调的物质包括溶血磷脂酰胆碱18∶1（2n异构）[lysoPC 18∶1（2n isomer）]、溶血磷脂酰乙醇胺18∶3（lysoPE 18∶3）、溶血磷脂酰乙醇胺18∶2（lysoPE 18∶2）、溶血磷脂酰乙醇胺18∶2（2n异构）[lysoPE 18∶2（2n isomer）]、环（脯氨酸-脯氨酸）[cyclo（Pro-Pro）]等。大部分差异物质为脂质，主要集中在下调物质中，分为溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺两种。MM vs MF中上调的物质包括鸟苷3'，5'-环单磷酸（guanosine 3'，5'-cyclic monophosphate）、3，4'-二羟基-3'-甲氧基苯戊酸（3，4'-dihydroxy-3'-methoxybenzenepentanoic acid）、D-阿拉伯糖醇（D-arabitol）、丙酮酸（pyruvic acid）、N-γ-乙酰基-N-2-甲酰基-5-甲基犬尿氨酸（N-γ-acetyl-N-2-formyl-5-methoxykynurenamine）等；下调的物质包括溶血磷脂酰胆碱18∶1（2n异构）[lysoPC 18∶1（2n isomer）]、溶血磷脂酰乙醇胺18∶3（lysoPE 18∶3）、溶血磷脂酰乙醇胺18∶2（lysoPE 18∶2）、溶血磷脂酰乙醇胺18∶2（2n异构）[lysoPE 18∶2（2n isomer）]、环（脯氨酸-脯氨酸）[cyclo（Pro-Pro）]。MP vs MF中上调的物质包括D-阿拉伯糖醇（D-arabitol）、D-（-）-苏阿糖（D-（-）-threose）、E，E，Z-1，3，12-十九碳三烯-5，14-二醇（E，E，Z-1，3，12-nonadecatriene-5，14-diol）、N-乙酰-L-苯丙氨酸（N-acetyl-L-phenylalanine）、肉桂酰酪胺（cinnamoyltyramine）等；下调的物质包括L-谷氨酰胺（L-glutamine）、N-单甲基-L-精氨酸（N-monomethyl-L-arginine）、N'，N''，N'''-对香豆酰肉桂酰咖啡酰亚精胺（N'，N''，N'''-p-coumaroyl-cinnamoyl-caffeoyl spermidine）、2，4-二羟基喹啉（2，4-dihydroxyquinoline）、吡咯啉（pyrroline）等。主要分为脂质、氨基酸及其衍生物、生物碱等。说明这些差异代谢物可能与平菇子实体发育存在一定的相关性，这些差异代谢物参与到平菇子实体发育过程中，并在其中发挥重要的作用。

2.4 差异代谢通路分析

不同生物体中各种代谢产物在细胞内相互作用，并通过不同代谢途径和通路进行表达（KEGG：kyoto encyclopedia of genes and genomes）。差异代谢物的通路富集分析有助于了解和分析代谢途径的变化机制，通过KEGG Pathway数据（https：//www.kegg.jp/kegg/kegg2.html）注释检测代谢通路并进行通路富集分析。KEGG通路富集分析结果显示，各组的差异代谢物主要分布在20条代谢途径中（图8）。MM vs MP中的明显差异代谢通路有4条，为苯丙氨酸代谢（phenylalanine metabolism）、色氨酸代谢（tryptophan metabolism）、膦酸酯和次膦酸酯代谢（phosphonate and phosphinate metabolism）、单胺菌素生物合成（monobactam biosynthesis）。MM vs MF中的明显差异代谢通路有6条，为硫胺素代谢（thiamine metabolism）、嘌呤代谢（purine metabolism）、碳代谢（carbon metabolism）、氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）、维生素B6代谢（vitamin B6 metabolism）和糖酵解/糖异生（glycolysis / gluconeogenesis）。MP vs MF的明顯差异代谢通路仅有1条，为嘌呤代谢（purine metabolism）。

2.5 差异代谢物相关性分析

对平菇子实体发育过程中发生显著相关（|r|＞0.8，p＜0.01）的代谢物间代谢网络情况进行了分析。如图9所示，共有214个代谢物间呈显著相关，且主要呈正相关，占总相关性的81.78%。主要存在于脂质、有机酸、核苷酸及其衍生物以及氨基酸及其衍生物之间，如ASV_39胸腺嘧啶与ASV_132 S-烯丙基-L-半胱氨酸（r=1，p=0）、ASV_152 1-甲基黄嘌呤（r=0.98，p=6.43×10-6）、ASV_436溶血磷脂酰胆碱18∶1（2n异构）（r=0.98，p=6.43×10-6）；ASV_207 2，6-二氨基庚二酸与ASV_360 9，10，13-三羟基-11-十八碳烯酸（r=0.98，p=1.94×10-6）、ASV_379鸟苷3'，5'-环单磷酸（r=0.93、p=2.48×10-4）、ASV_56 L-鸟氨酸（r=0.98、p=4.27×10-6）；ASV_140 2，4-二氧四氢蝶啶与ASV_255 L-赖氨酸丁酸酯（r=1、p=0）、ASV_36 烟酸（r=0.95、p=8.76×10-5）；ASV_89 2-乙酰-2-羟基丁酸与ASV_52 3-脱氢-L-苏糖酸（r=0.96、p=3.29×10-5）、ASV_238环（脯氨酸-亮氨酸）（r=0.95、p=6.58×10-5）、ASV_402 溶血磷脂酰乙醇胺16∶0（r=0.98、p=4.27×10-6）；ASV_390琥珀酰腺苷与ASV_201 L-甘氨酰-L-异亮氨酸（r=0.97、p=2.16×10-5）、ASV_415溶血磷脂酰乙醇胺18∶0（2n异构）（r=0.98、p=1.94×10-6）、ASV_403溶血磷脂酰乙醇胺16∶0（2n异构）（r=0.97、p=2.16×10-5）、ASV_256 L-丙氨酰-L-苯丙氨酸（r=0.98、p=1.94×10-6）。

3 讨论与结论

笔者采用UPLC-ESI-MS/MS结合多元统计学分析方法对发菌完成期、原基期及子实体分化期的平菇菌丝体进行代谢组学分析。结果表明，平菇菌丝体中的大部分代谢物含量在原基期降低，子实体分化后明显增加。其中，氨基酸及其衍生物、脂质、生物碱、有机酸等变化最为明显。

氨基酸和有机酸类物质含量在原基期降低，子实体分化期升高。这一现象与真菌菌丝的生长规律一致。担子菌如平菇、杏鲍菇、金针菇和香菇，可以通过酶降解培养料中的蛋白质或高分子物质，将其转化为易于吸收利用的氨基酸等低分子物质，然后被真菌菌丝吸收，以促进生长和成熟，这一过程称为营养吸收进程。在原基形成过程中，由于菌丝代谢的减慢，导致胞外酶水平降低，因此，降解产物的浓度也相应降低[13]。平菇子实体从分化期到完全成熟一般仅需7 d，在此过程中氨基酸参与子实体中新蛋白质合成或为呼吸氧化提供碳架，菌丝体需要大量合成或分解蛋白质为氨基酸，满足子实体快速生长所需，因而菌丝体中的氨基酸含量在子实体分化期呈上升趋势[2，16]。磷脂是构成细胞生物膜的基本组成部分，是生物体代谢过程中所必需的营养成分[17]。在平菇菌丝体鉴定出磷脂主要是溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰胆碱。溶血磷脂是细胞膜中的一类脂质代谢中间产物，主要由磷脂分子被水解后生成，在真核细胞中，溶血磷脂是一种参与多种胞内生物信号调控的重要活性分子[18]。但是，溶血磷脂在食用菌中的生理学功能目前还未被清晰阐释[19]。在平菇子实体发育过程中，菌丝体中的溶血磷脂含量在原基期主要呈下降趋势，如原基期菌丝体中的LysoPC 17∶1、LysoPC 18∶3、LysoPE 18∶2、LysoPE 18∶3分别是发菌完成期菌丝体中的3.32×10-4倍、9.82×10-5倍、6.99×10-5倍和8.04×10-5倍；而在子实体分化期呈上升趋势，如子实体期菌丝体中的LysoPC16∶1 （2n isomer）、LysoPC 16∶1、LysoPE 16∶1 （2n isomer）、LysoPE 15∶1 （2n isomer）、LysoPE 16∶1分别是原基期菌丝体中的14.51倍、14.44倍、8.78倍、8.54倍和8.52倍。这些明显上调及下调的溶血磷脂可能对平菇子实体的发育起着一定的调控作用，值得今后进一步探究。糖类作为生物体重要的碳源物质为子实体发育提供条件[16]。在本研究中，子实体分化期时菌丝体中的阿拉伯糖醇Arabitol和苏阿糖Threose含量明显增加，是原基期菌丝体中的3 296.30倍和1 444.44倍，这些糖类可能作为供能物质或多糖合成原料促进子实体快速生长。

相关性分析表明，脂质、有机酸、核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物等相关代谢物之间在子实体发育过程中明显呈正相关，暗示这些代谢物可能共同参与子实体的发育过程。氨基酸代谢是子实体发育过程中必不可少的[20]，在本研究中，氨基酸与脂质、有机酸、核苷酸等化合物可能一起作用驱动细胞代谢进而促进子实体发育。但是，在平菇子实体发育过程中如何启动氨基酸、脂质、有机酸、核苷酸等基础代谢，有待于后续转录组学、基因组学等综合分析，为解析子实体发育机制提供更多依据。

笔者利用非靶向代谢组学研究了平菇子实体发育过程中菌丝体中代谢物含量的差异，对不同发育阶段菌丝体中的差异代谢物进行了筛选及代谢通路鉴别，可以为平菇子实体发育机制解析、优良品种选育和标准化栽培提供一定的理论依据，并可推动其他食用菌品种资源的开发利用。

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