冬瓜枯萎病菌的分离、鉴定及冬瓜种质抗性鉴定

曾莉莎 陈康丽 杜彩娴 李洪波 苗兵兵 莫伟钦 吕顺

摘    要：冬瓜在瓜類蔬菜生产中占有重要地位，而枯萎病严重威胁冬瓜的安全生产。通过病原菌致病力测定、形态学特征观察、培养特性比较，以及基于翻译延伸因子（TEF-1α）的系统发育分析，对采自广东、广西等地的冬瓜枯萎病病原菌进行鉴定，将引起冬瓜枯萎病的病原鉴定为尖孢镰刀菌冬瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. benincasae）。在此基础上，选取致病力较强的冬瓜枯萎病菌株，以不同冬（节）瓜资源为材料，采用苗期灌根接种法对所收集的26份小冬瓜资源、47份节瓜资源和74份大冬瓜资源进行抗病性鉴定。结果表明，147份冬（节）瓜资源的抗性鉴定结果差异相对较大，且不同冬（节）瓜资源间的枯萎病发病率存在显著差异，其中26份小冬瓜资源中没有1份高抗材料；47份节瓜资源中有2份高抗材料（JG-25和JG-33），占比4.26%；74份大冬瓜资源中有4份高抗材料（DDG-19、DDG-32、DDG-40和DDG-74），占比5.41%。研究结果为抗枯萎病冬瓜种质资源的筛选及瓜类枯萎病抗性遗传育种提供参考。

关键词：冬瓜；节瓜；枯萎病；病原菌; 抗性鉴定；

中图分类号：S642.3 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）01-064-12

Isolation and identification of Fusarium wilt pathogen from wax gourd and identification of resistance of wax gourd germplasm

ZENG Lisha， CHEN Kangli， DU Caixian， LI Hongbo， MIAO Bingbing， MO Weiqin，LÜ Shun

（Dongguan Agricultural Research Centre， Dongguan 523000， Guangdong ，China）

Abstract： Wax gourd is one of the major vegetable crops in Cucurbitaceae family， and the Fusarium wilt disease seriously threatens the safety of wax gourd production. The pathogenicity， morphological characteristics， and cultural characteristics of phytopathogen based on translation elongation factor （TEF-1a）through phylogenetic analysis were compared in this study， the Fusarium wilt pathogens of wax gourd collected from Guangdong， Guangxi and other regions were identified， and the pathogen causing Fusarium wilt of wax gourd was identified as Fusarium oxysporum f.sp. benincasae. On this basis， the strong pathogenic ability strains were selected as the inoculum， and using different wax gourd resources as materials， we analyzed the disease resistance of 26 small wax gourd resources， 47 chieh-qua resources， and 74 large wax gourd resources by seedling root-irrigation inoculation method. There were relatively significant differences in the disease resistance results of 147 wax gourd and chieh-qua resources， and there were significant differences in the incidence of Fusarium wilt among different wax gourd and chieh-qua resources. None of 26 small wax gourd resources had high resistance to Fusarium wilt; two（JG-25 and JG-33） of the 47 Chieh-qua resources showed high resistance， accounting for 4.26%; four（DDG-19， DDG-32， DDG-40， and DDG-74）of the 74 large wax gourd resources showed high resistance， accounting for 5.41%. This study provides reference for the selection of resistant germplasm resources of wax gourd and the genetic breeding of Fusarium wilt resistance in Cucurbitaceae crops.

Key words： Wax gourd; Chieh-qua; Fusarium wilt ; Pathogen; Disease resistance identification

冬瓜（Benincasa hispida Cogn．）属葫芦科冬瓜属一年生蔓性草本植物，起源于中国和东印度，在我国已有2000多年的栽培历史，主要分布于广东、广西、海南等地区[1-2]。冬瓜营养丰富，富含多种人体必需营养元素和各种维生素[3]，加之冬瓜具有易栽培、产量高、耐贮运等优点，已成为近年来各地助力产业振兴的优选蔬菜种类[2]。然而，随着冬瓜复种指数的提高、资源单一化和种植地区集中化，病害的发生日益突出，尤其是枯萎病，部分冬瓜产区的枯萎病发病率高达70%，严重的甚至绝收，给农户带来了巨大损失，枯萎病已成为冬瓜可持续健康发展的瓶颈[4]。

葫芦科瓜类枯萎病尖孢镰刀菌共存在8个专化型[5]。尖孢鐮刀菌的鉴定主要包括形态学观察、致病性检测和分子生物学鉴定3种方法[6]。一般使用通用引物 ITS1 和 ITS4 扩增分离物鉴定DNA，将菌株 rDNA-ITS 序列在GenBank核酸数据库中进行比对。目前，NCBI 数据库中有大量的镰刀菌 ITS序列，尽管rDNA-ITS序列在镰刀菌属不同种间的鉴别能力较强，但不能把菌株与种内的其他专化型菌株区分成不同类群。TEF-1α是目前尖孢镰刀菌系统发育研究中应用最多的基因片段，O’Donnell等[7]采用TEF-1α和IGS两个基因片段对来源于植物和人类的病原尖孢镰孢菌（F. oxysporum）进行了系统分析，认为TEF-1α是适用于Fusarium群体遗传多样性分析的基因片段，但是目前我国还未见利用TEF-1α等基因片段对引起瓜类枯萎病的尖孢镰刀菌进行鉴定或系统发育研究的报道。

针对冬瓜枯萎病的防治，目前有化学防治、选育抗病资源、嫁接换根、轮作等防治措施[8-9]，其中以化学防治为主。常见防治冬瓜枯萎病的药剂有恶霉灵、精甲咯菌腈、多菌灵可湿性粉剂等药剂[10-11]。但化学防治有一定弊端，可以杀死病菌，也会杀死土壤中大量的有益微生物，使土壤的自我修复能力降低，甚至丧失土壤修复能力。化学防治还具有使病菌产生抗药性、蔬菜残留农药和污染土壤环境等副作用。因此，选育抗枯萎病冬瓜（节瓜）品种尤为重要。目前市场上的冬瓜（节瓜）资源大部分以中抗和中低抗枯萎病品种为主，高抗品种较少。康德贤等[4]采用自然病圃法对36份冬瓜种质资源进行抗枯萎病鉴定，结果表明，仅7份材料表现高抗，占总数的19.40%。梁少丽等[12]采用苗期接种鉴定法对东莞市16份冬瓜种质资源进行枯萎病抗性鉴定，结果表明，仅1份材料表现高抗，占总数的6.25%。彭家柱等[13]采用浸根法对20份节瓜资源（经多代自交、分离并最终稳定的自交系）进行枯萎病抗性鉴定，结果表明，无材料表现高抗[13]。谢大森等[14]采用人工接种法对84份冬瓜种质资源进行枯萎病抗性鉴定，结果表明，仅5份黑皮冬瓜材料表现高抗，占总数的5.9 %。

笔者从广东、广西等冬瓜主栽区采集罹患枯萎病的冬瓜病株，采用组织分离法，从发病植株茎基部上分离病原菌，从病菌的形态学特征、培养特性、TEF-1α序列及致病性等方面进行分析鉴定。然后采用苗期接种法对从华南地区收集的26份小冬瓜资源、47份节瓜资源和74份大冬瓜资源进行枯萎病抗性鉴定，筛选出高抗资源，以期为不同抗病性冬瓜资源的合理布局和冬瓜枯萎病的生物生态防治提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2020年春秋两季在东莞市农业科学研究中心万江基地实验室对具有典型感病症状的材料进行病原物分离。供试病原菌包括采自广东、广西不同地区具有代表性的6个冬瓜枯萎病菌株，其来源及编号见表1。

用于致病力测定的冬瓜材料是XDG-7、 XDG-8，均为稳定的多代自交系，据多年田间观测，田间表现为中低抗枯萎病。

待鉴定冬（节）瓜资源 ：在2021年，结合全国冬瓜产业大会，从广东、广西、福建及湖南等冬瓜主产区引进收集了26份小冬瓜、47份节瓜和74份大冬瓜资源，共计147份资源，大部分为杂交种F1代，少数为自交多代的稳定自交系。其中XDG1～26是小冬瓜，JG1～47是节瓜，DDG1～74是大冬瓜。本文中的冬瓜资源为2021年全国冬瓜产业大会中面向冬（节）瓜育种研究单位、品种推广部门以及种业销售公司征集的新优冬（节）瓜品种，由广州种子商会征集并提供。

1.2 病原菌的分离、纯化及形态鉴定

采用组织分离法，从发病植株茎基部上分离病原菌，用2%次氯酸钠消毒60 s，75%乙醇消毒3 次，随后用无菌水洗涤，再用灭菌过的吸水纸吸干水分，置于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基上28 ℃培养。待长出菌丝后，挑取部分菌丝接种在PDA平板上，经3次纯化后，采用稀释法进行单孢分离和培养，观察其生长性状，在显微镜条件下观察气生菌丝上小型分生孢子的着生状态、大小、形状，分生孢子座上的大孢子以及厚垣孢子的形态。据柯赫氏法则将菌株回接冬瓜幼苗上，接种18株，3次重复，无菌水为对照。对发病冬瓜幼苗进行病原物的再分离，与原接种菌株比较，进行柯赫氏法则验证。

1.3 致病菌的TEF-1α序列分析

采用CATB法进行菌体基因组DNA的提取。用镰刀菌（Fusarium）种类鉴定通用引物翻译延伸因子（TEF-1α）扩增病原菌基因组总DNA。引物序列为EF1H（ATGGGTAAGGAAGACAAGAC）和EF2T（GGAAGTACCAGTGATCATGTT）。使用 MEGA version 7.0构建系统发育树，进化距离分析采用邻位相连法（neighbor-joining，NJ），用 Bootstrap 1000次重复进行系统树的检验。将菌株TEF-1α序列在 GenBank 核酸数据库（ http： / / www. ncbi. nlm. nih. gov / BLAST）及Fusarium MLST database（https：//fusarium.mycobank.org/）中进行 BLASTN 比对和同源性分析。

1.4 育苗

冬（节）瓜种子播种前用温汤浸种6 h，然后置于28 ℃条件下催芽，2～3 d 后播于灭过菌的穴盘中。待幼苗长出真叶后，用于苗期人工接种。

1.5 冬瓜枯萎病菌孢子悬浮液的制备

选取致病力强且生长旺盛的冬瓜枯萎病菌丝接种于液体培养基中，于28 ℃条件下震荡培养3～5 d。将培养液用双层纱布过滤去掉菌丝，滤液离心后，去除上清液。用血球计数器计算病菌孢子的浓度，小孢子接种浓度为1×106 个·mL-1。

1.6 苗期人工接种枯萎病鉴定与病情分级标准

选取长势健壮、大小基本一致、株高为10～15 cm的冬（節）瓜实生苗用栽培基质种植于盆钵中，7 d 后用1×106 个·mL-1的冬瓜枯萎病菌孢子悬浮液伤根浇灌接种（浇灌前在距根际1 cm 的4个方向各切一刀），每株浇灌10 mL，以清水处理为对照，每个处理组分别接种30株瓜苗[15-16]。接种温度22～25 ℃，用无色塑料膜保湿24 h，保湿后的植株置于白天25 ℃左右、夜晚18 ℃左右的温室内正常管理。接种7 d后开始调查发病情况，统计并记录147份冬（节）瓜资源枯萎病发病率，采用SPSS 23.0进行统计和差异显著性分析。

参照康德贤等[4]的方法进行抗性分级，将冬瓜资源对枯萎病的抗性分为4个等级：高抗（HR），枯萎病发病率低于20%；中抗（MR），枯萎病发病率21%～50%；轻抗（LR），枯萎病发病率51%～80%；感病（S），枯萎病发病率81%～100%。采用SPSS 23.0对数据进行统计和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 冬瓜枯萎病菌的分离与纯化

将分离纯化后的菌株接种于PDA平板内，28 ℃培养3 d 后，肉眼观察菌落形态，发现其菌丝致密絮状，白色至淡紫色。显微镜下观测其小型分生孢子呈长椭圆形、纺锤形、直或略弯曲成肾形等，假头生，大型分生孢子呈镰刀形，多为3～5分隔。厚垣孢子较易形成，数量多，球形或亚球形。以上形态学特征符合尖孢镰孢菌（F. oxysporum）的形态描述（图1）。

2.2 分离的枯萎病菌致病性鉴定

将分离得到的尖孢镰刀菌孢子悬浮液接种于冬瓜幼苗上，结果表明，该菌株对冬瓜具有强致病性。冬瓜幼苗于接种7 d时，开始出现轻微萎蔫症状；接种10 d 左右，植株大部分叶片出现萎蔫症状；接种20 d 后，植株表现为黄叶、萎蔫甚至死亡症状；病害后期常能看到藤蔓中下部至茎基部出现红褐色纵裂条纹，在潮湿条件下表皮腐烂，剖开病株可发现其维管束变成褐色；但清水处理（CK）的植株正常生长，无萎蔫症状（图 2）。重新分离接种的病原菌再回接到健康的冬瓜植株上，均获得与接种时相同的病原物；清水对照（CK）未分离到病原物。

2.3 TEF-1α序列测定

从 GenBank 数据库中下载27株镰刀菌菌株的TEF-1α序列，与供试菌株的TEF-1α序列采用MEGA 7.0 软件进行一致性比对，构建系统发育树。从图3可以看出，6个冬瓜枯萎病菌株NLDG-10-1、NLDG-10-4、NLDG-5-3、YLDG-1-2、YLDG-2-6和DGDG-1-4与尖孢镰刀菌不同专化型聚在一起（支持率为 99%），且与引起葫芦科瓜类枯萎病的尖孢镰刀菌西瓜专化型 F. oxyspoorum f. sp. niveum、尖孢镰刀菌黄瓜专化型 F. oxyspoorum f. sp. cucumerinum、尖孢镰刀菌甜瓜专化型 F. oxyspoorum f. sp. melonis和尖孢镰刀菌瓜类专化型 F. oxyspoorum f. sp. cucurbitacearum亲缘关系最近，进一步支持了分离致病菌为尖孢镰刀菌冬瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. benincasae）。

从聚类分析结果可以看出，TEF-1α序列在镰刀菌属不同种间的鉴别能力较强，且能把冬瓜枯萎病菌株与尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum species complex，FOSC）种内的其他专化型菌株区分成不同类群，能较好地反映FOSC内菌株间的亲缘关系。

2.4 26份小冬瓜资源枯萎病发病率和抗性鉴定结果分析

如表2所示，26份小冬瓜资源有3种类型，其中黑皮小冬瓜10份，占比38.46%；粉皮小冬瓜8份，占比30.77%；青皮小冬瓜8份，占比30.77%。经分析，26份小冬瓜资源的抗性鉴定结果差异相对较大，且不同小冬瓜资源间的枯萎病发病率存在显著差异。26份小冬瓜资源枯萎病平均发病率为70.48%，其中XDG-17粉皮小冬瓜枯萎病发病率最高，达100.00%，XDG-13粉皮小冬瓜枯萎病发病率最低，为30.00%。26份小冬瓜资源中没有1份小冬瓜的抗性鉴定结果为高抗；4份小冬瓜资源（XDG-4、XDG-6、XDG-8和XDG-13）的抗性鉴定结果为中抗，占比15.39%；17份小冬瓜资源的抗性鉴定结果为轻抗，占比65.38%；剩余5份小冬瓜资源的抗性鉴定结果为感病，占比19.23%。

2.5 47份节瓜资源枯萎病发病率和抗性鉴定结果分析

47份节瓜资源的抗性鉴定结果如表3所示，差异相对较大，且不同节瓜资源间的枯萎病发病率存在显著差异。47份节瓜资源枯萎病平均发病率为51.68%，其中JG-36节瓜枯萎病发病率最高，达90.00%，JG-33节瓜枯萎病发病率最低，达10.90%。47份节瓜资源中有2份节瓜（JG-25和JG-33）资源的抗性鉴定结果为高抗，占比4.26%；20份节瓜资源的抗性鉴定结果为中抗，占比42.55%；21份节瓜资源的抗性鉴定结果为轻抗，占比44.68%；剩余4份节瓜资源的抗性鉴定结果为感病，占比8.51%。

2.6 74份大冬瓜资源枯萎病发病率和抗性鉴定结果分析

如表4所示，74份大冬瓜资源有2种类型，其中黑皮大冬瓜67份，占比90.54%；粉皮大冬瓜7份，占比9.46%。经分析，74份大冬瓜资源的抗性鉴定结果差异相对较大，且不同大冬瓜资源间的枯萎病发病率存在显著差异。74份大冬瓜资源枯萎病平均发病率为52.24%，其中DDG-23黑皮大冬瓜枯萎病发病率最高，高达96.97%，DDG-19黑皮大冬瓜枯萎病发病率最低，达5.90%。74份大冬瓜资源中有4份大冬瓜资源（DDG-19、DDG-32、DDG-40和DDG-74）的抗性鉴定结果为高抗，占比5.41%；31份大冬瓜资源的抗性鉴定结果为中抗，占比41.89%；32份大冬瓜资源的抗性鉴定结果为轻抗，占比43.24%；剩余7份大冬瓜资源的抗性鉴定结果为感病，占比9.46%。

3 讨论与结论

冬瓜枯萎病是一种土传真菌性、由土壤传播、从植株根或根茎部侵入、在维管束内寄生的系统性病害，致病菌为尖孢镰刀菌冬瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. benincasae）[17]。20世纪90年代，Gertagh 等[18]首次报道了尖孢镰刀菌冬瓜专化型的存在。1994年，中国学者谢双大等[19]报道了尖孢镰刀菌冬瓜专化型的存在，表明该病原菌致病专化性较强，仅侵染瓜类作物，引致冬瓜和节瓜严重枯萎，且致病性与黄瓜、西瓜、丝瓜、苦瓜等专化型有明显差异，尖孢镰刀菌冬瓜专化型是导致冬瓜枯萎病发生的真菌专化型。

据文献报道，瓜类枯萎病菌至少存在8个专化型，即尖孢镰刀菌西瓜专化型 F. oxyspoorum f. sp. niveum、尖孢镰刀菌黄瓜专化型 F. oxyspoorum f. sp. cucumerinum、尖孢镰刀菌甜瓜专化型 F. oxyspoorum f. sp. melonis、尖孢镰刀菌葫芦专化型 F. oxyspoorum f. sp. lagenariae、尖孢镰刀菌冬瓜专化型 F. oxysporum f. sp. benincasae、尖孢镰刀菌苦瓜专化型 F. oxyspoorum f. sp. momodicase、尖孢镰刀菌丝瓜专化型 F. oxyspoorum f. sp. luffae 和尖孢镰刀菌瓜类专化型 F. oxyspoorum f. sp. cucurbitacearum，各专化型对瓜类作物的致病性存在明显差异[5]。目前对我国瓜类枯萎病的病原种群多样性及致病力分化情况还没系统研究，笔者从病原菌的形态学特征、培养特性、TEF-1α序列及致病性等方面对引起广东、广西、湖南冬瓜主栽区枯萎病的病原菌进行鉴定，结果表明，致病菌的形态学特征符合尖孢镰孢菌（F. oxysporum）的形态描述，引起冬瓜和节瓜严重枯萎，且TEF-1α序列分析结果显示致病菌与尖孢镰刀菌冬瓜专化型的亲缘关系最近。因此，将引起广东、广西、湖南冬瓜主栽区枯萎病的病原菌鉴定为尖孢镰刀菌冬瓜专化型。

TEF-1α是适用于Fusarium群体遗传多样性分析的基因片段，本文中基于TEF-1α序列的系统发育分析，表明冬瓜枯萎病菌株与尖孢镰刀菌不同专化型聚在一起，且与引起葫芦科瓜类枯萎病的尖孢镰刀菌西瓜专化型 F. oxyspoorum f. sp. niveum、尖孢镰刀菌黄瓜专化型 F. oxyspoorum f. sp. cucumerinum、尖孢镰刀菌甜瓜专化型 F. oxyspoorum f. sp. melonis和尖孢镰刀菌瓜类专化型 F. oxyspoorum f. sp. cucurbitacearum亲缘关系最近。此结果表明，TEF-1α序列在镰刀菌属不同种间的鉴别能力较强，且能把冬瓜枯萎病菌株与尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum species complex，FOSC）种内的其他专化型菌株区分成不同类群，能较好地反映FOSC内菌株间的亲缘关系。

冬瓜枯萎病病原菌随病残体在土壤或粪肥中越冬，借灌水、气流、风雨等进行传播蔓延，加上我国华南地区夏季高温多雨等气候条件，极易导致冬瓜枯萎病的暴发[20]。目前生产上针对冬瓜枯萎病以化学防治为主，但长期以来化学防治效果不理想，加上市面上很多针对冬瓜（节瓜）枯萎病的化学药剂是以预防为主，因此选用抗病性较强的冬瓜品种是解决枯萎病问题最有效的途径之一[21]。笔者采用苗期接种法对所收集的26份小冬瓜资源、47份节瓜资源和74份大冬瓜资源进行抗病性鉴定，结果表明，从47份节瓜资源中筛选出2份节瓜（JG-25和JG-33）为高抗资源，占比4.26%；从74份大冬瓜資源筛选出4份大冬瓜（DDG-19、DDG-32、DDG-40和DDG-74）为高抗资源，占比5.41%。26份小冬瓜资源、47份节瓜资源和74份大冬瓜资源的抗性结果表现呈正态分布，即高抗和感病资源较少，中抗和轻抗资源较多，与康德贤等[4]、梁少丽等[12]、彭家柱等[13]和谢大森等[14]的研究结果一致。笔者筛选出4份大冬瓜和2份节瓜资源可为利用不同抗枯萎病的冬瓜资源进行合理布局（搭配种植）提供参考。但是，笔者只是基于苗期接种法对部分冬瓜（节瓜）资源的抗病性进行初步鉴定，接下来还需开展更广泛、更深入的田间抗病性评价试验，进一步明确不同冬瓜（节瓜）资源的抗感病情况。

综上所述，通过病原菌致病力测定、形态学特征分析、培养特性比较以及构建的TEF-1α系统发育树分析，将引起冬瓜枯萎病的病原菌鉴定为尖孢镰刀菌冬瓜专化型。笔者筛选出在苗期接种鉴定中表现为高抗的4份大冬瓜和2份节瓜资源，为利用不同抗枯萎病的冬瓜资源进行合理布局和抗枯萎病冬瓜种质资源的筛选及瓜类枯萎病抗性遗传育种提供参考。

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