透明质酸栓塞对动脉壁结构以及动脉血中IL-1、VEGF和MMP9表达的影响

陈爱萍 吴伟东 王瑛 古佳升

[摘 要]目的 探討透明质酸栓塞后对动脉壁的影响，以及对白介素1（IL-1）、基质金属蛋白酶9（MMP9）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达差异。方法 将9只白兔采用随机数字表法分为对照组、HA组和结扎组，各3例。对照组注射生理盐水，HA组注射透明质酸栓塞血管，结扎组使用外科缝线结扎动脉血管阻断血管血流。术前、注射后1、3、5 d抽取各组兔耳中央动脉栓塞部位远心端血液5 ml，实时荧光PCR法检测其动脉血中IL-1、MMP9和VEGF表达水平，并进行组间比较。第5天终止实验，处死所有白兔，取兔耳中央动脉血管壁经HE染色后在显微镜下观察。结果 QPCR结果显示：结扎组与HA组IL-1、MMP9和VEGF的表达水平均高于对照组（P<0.05）；结扎组IL-1、MMP9和VEGF表达水平均高于HA组（P<0.05）。HE染色结果显示：对照组动脉壁结构完整；HA组有轻微内膜增生；结扎组内膜增生严重，平滑肌层紊乱。结论 透明质酸注射栓塞血管或动脉结扎血管均可引起动脉血IL-1、MMP9和VEGF表达水平升高，引起动脉壁重塑，但透明质酸注射引起的栓塞较结扎动脉对IL-1、MMP9和VEGF表达水平及动脉壁重塑的影响更小。

[关键词] 透明质酸；动脉栓塞；基质金属蛋白酶

[中图分类号] R543 [文献标识码] A [文章编号] 1004-4949（2024）01-0036-05

Effects of Hyaluronic Acid Embolization on the Structure of Arterial Wall and the Expression of IL-1， VEGF and MMP9 in Arterial Blood

CHEN Ai-ping1， WU Wei-dong1， WANG Ying2， GU Jia-sheng1

（1.Department of Cardiothoracic Surgery， Guangzhou Red Cross Hospital Affiliated to Jinan University， Guangzhou 510000， Guangdong， China； 2.Guangzhou Xiaoman Waist Medical Equipment Co.， LTD.， Guangzhou 510000， Guangdong， China）

[Abstract]Objective To investigate the effect of hyaluronic acid embolization on arterial wall and the expression of interleukin 1 （IL-1）， matrix metalloproteinase 9 （MMP9） and vascular endothelial growth factor （VEGF）. Methods Nine white rabbits were randomly divided into control group， HA group and ligation group， with 3 rabbits in each group. The control group was injected with normal saline， the HA group was injected with hyaluronic acid to embolize the blood vessels， and the ligation group was ligated with surgical suture to block the blood flow of the blood vessels. 5 ml blood samples were collected before operation and 1， 3 and 5 days after injection， and the expression levels of IL-1， MMP9 and VEGF in arterial blood were detected by real-time PCR. All white rabbits were sacrificed on the 5th day， and the vascular wall of the central artery of the rabbit ear was stained with HE and observed under a microscope. Results The QPCR results showed that expression levels of IL-1， MMP9 and VEGF in ligation group and HA group were higher than those in control group （P<0.05）， and the expression levels of IL-1， MMP9 and VEGF in the ligation group were higher than those in the HA group （P<0.05）. HE staining results showed that the arterial wall structure of the control group was intact. There was slight intimal hyperplasia in HA group. The intimal hyperplasia was severe and the smooth muscle layer was disordered in the ligation group. Conclusion The expression levels of IL-1， MMP9 and VEGF in arterial blood can be increased by hyaluronic acid injection embolization or artery ligation， which can lead to arterial wall remodeling. However， the embolization caused by hyaluronic acid injection has less effect on the expression levels of IL-1， MMP9 and VEGF and arterial wall remodeling than that of artery ligation.

[Key words] Hyaluronic acid； Arterial embolism； Matrix metalloproteinase

目前，透明质酸（hyaluronic acid，HA）已经广泛用于皮肤美容，但注射不当会引起皮肤坏死、肿块、脱发等多种不良反应，其中动脉栓塞是HA注射不良反应中最严重的并发症[1]。由于头颈面部的血管解剖结构复杂，注射过程中可能导致HA进入血管，引起血管栓塞，并造成组织缺氧、坏死等不良反应[2]。近年来，HA注射后血管栓塞引起组织缺氧坏死的机制有了一定的研究成果[3，4]，但在血管微观下的影响尚未报道。白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9，MMP9）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）均能通过不同机制参与血管重构[5-7]。HA在体外实验中发现能促进血管内皮细胞增殖、迁移，但HA引起栓塞后，在血管内是否会通过各种机制加重血管壁的损伤重塑，尚无研究。本实验就通过构建HA引起的动脉栓塞模型，以物理结扎为对照，评价HA栓塞后短期内血管壁在微观下的改变以及各种细胞分子的表达水平。

1.1 实验动物 成年实验雄性新西兰兔9只，周龄6周，体重3～3.5 kg（购自广东明珠生物科技有限公司）。动物实验通过动物伦理审批（伦理审批号：C202307-10），按照《国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》进行饲养。兔在室温（25±2）℃，相对湿度（50±5）%，12 h明暗交替的环境下分笼饲养，自由摄食饮水，饲养7 d。

1.2 主要试剂与仪器 台式高速冷冻离心机[天美仪拓实验室设备（上海）有限公司，型号：CT14RDⅡ]；实时荧光定量PCR仪[闳龙生物科技（上海）有限公司型号CFX96，品牌：BIORAD]；显微镜[成贯仪器（上海）有限公司，型号：尼康CI-S]；摊烤片机（湖北安立信医疗实业有限公司，型号：ATK-7）；脱水机（型号：JJ-12J）和包埋机（型号：JB-P5）均购自武汉俊杰电子有限公司；Trizol-RNA提取试剂（湖南艾科瑞生物工程有限公司，型号：AG21101）；注射用透明质酸钠（华熙生物科技股份有限公司，批准文号：20143132037，规格：0.5 ml∶10 mg）；荧光素钠注射液（广州白云山明兴制药有限公司，国药准字H44023401，规格：3 ml）；IL-1、MMP9、VEGF和GADPH引物均由广州伯信生物科技有限公司提供。

1.3 实验分组 9只白兔采用完全随机抽样法分为对照组，HA组和结扎组，各3例。对照组注射生理盐水、HA组注射透明质酸，结扎组使用外科缝线结扎血管。

1.4 实验方法

1.4.1构建兔耳中央动脉栓塞模型 固定白兔，去除兔耳被毛，采用7%水合氯醛经耳缘静脉注射麻醉，注射量3.5～4.5 ml/kg体重。待白兔完全麻醉后，留置针刺入兔耳中央动脉，缓慢均匀注射透明质酸钠1 ml，减少血管被动扩张及材料向近端动脉的反流。注射完毕后予以加压包扎穿刺部位，确认动脉无漏血后，采用20%荧光素钠，剂量为15 mg/kg，经耳后静脉外侧支或耳前静脉注射荧光素钠，并在紫外光下观察，确认动脉栓塞成功。对照组操作同上，仅注射生理盐水。结扎组使用缝线结扎兔耳中央动脉，保障血流成功阻碍，其余操作同上。分别于0 d（术前）及术后1、3、5 d进行大体拍照记录。由于第5天观察到HA组动脉栓塞的血管开始出现通畅，于是选择终止了实验，处死兔后从中央动脉取样，进行后续HE染色实验。

1.4.2 QPCR法检测兔耳动脉血中IL-1、MMP9和VEGF的表达 分别在0 d（术前）及术后1、3、5 d抽取各组兔耳中央动脉栓塞部位远心端血液5 ml，置入离心管，在室温下以3000 r/min离心12 min，静置后收集上层清液，使用Trizol试剂提取总RNA，根据PCR逆转录试剂盒说明书进行逆录。采用2-ΔΔCt法对动脉血液中IL-1、MMP9和VEGF的表达水平进行相对定量分析。反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。引物序列见表1。

1.4.3 苏木精-伊红染色实验 切取兔耳中动脉组织后进行石蜡包埋，常规制片染色，在光学显微镜下找到目标部位，拍照。

1.5 统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（x-±s）表示，行t检验；P<0.05表示差异有统计学意义。

2.1 兔耳动脉血液IL-1、MMP9和VEGF表達水平比较 兔耳栓塞部位动脉血液取样后，QPCR结果显示：结扎组与HA组IL-1、MMP9和VEGF的表达水平均高于对照组（P<0.05）；结扎组IL-1、MMP9和 VEGF表达水平均高于HA组（P<0.05），见图1。

2.2 HE染色切片结果 在对照组中，动脉内膜、中膜及外膜结构层次整齐、分界清晰，内皮细胞及中膜平滑肌细胞排列整齐有序，中膜完整。在HA组中，动脉腔内可见透明质酸残留，少量巨噬细胞聚集，部分内膜结果破坏，内膜外出现一部分平滑肌细胞，中膜已出现在内膜内侧，中膜完整。在结扎组中，动脉腔内大量红细胞淤积，可见血栓形成，动脉内膜中大量巨噬细胞聚聚，大量的中膜生长至内膜内侧，中膜结构遭到破坏，变薄稀疏，结构紊乱，外膜结构不完整，见图2。

HA是细胞外基质的主要成分，常用于皮肤美容[8]。由于面部血管分支的复杂性及部分操作者技术不成熟操作不规范，血管栓塞事件常有报道[9-11]。研究透明质酸栓塞对血管的影响及机制具有重要意义。在生理状态下，内皮细胞和平滑肌细胞均能产生少量IL-1，但在病理状态下如缺氧、炎症反应时，IL-1大量表达[12]。IL-1在血管损伤后动脉中膜平滑肌细胞的迁移过程中发挥重要作用，可抑制IL-1表达，减轻内膜增生[5， 13]，因此IL-1的表达水平在一定程度能反应内膜增生的趋势。MMP9属于明胶酶，可降解各种胶原和包括弹力蛋白在内的多种蛋白[14]。VEGF是血管内皮细胞特异性结合生长因子，当炎症、缺氧等原因引起VEGF大量表达并激活后，VEGF引起血管通透性增加并促进内皮细胞和新生血管形成[15，16]。

在正常状态下，动脉壁内膜中并不存在平滑肌细胞，在血管损伤后，平滑肌细胞迁移至内膜增生，成为内膜的主要细胞[17]。在本实验中观察到，对照组HE染色切片镜下显示动脉各层结构清晰完整。在使用HA注射或结扎引起血管栓塞后，血流动力障碍形成，血管及周围组织缺氧，诱发炎症反应，各种炎细胞聚集，同时IL-1、MMP9及VEGF表达升高。VEGF引起的血管通透性增加进一步诱导炎细胞聚集，同时促进平滑肌细胞及内皮细胞增生，MMP9降解动脉壁中细胞外基质各种蛋白的同时，协同IL-1促进平滑肌细胞从中膜转移至内膜，平滑肌细胞进入中膜后继续增生，并伴随平滑肌细胞表型转化，促进血栓形成或引起动脉狭窄[18]。在第5天在HE染色切片下观察到HA组动脉的内膜中已经出现了少量的平滑肌细胞，动脉内膜中仅有少量中膜和巨噬细胞，但中膜结构仍然完整，结扎组内膜中出现了大量的平滑肌细胞和巨噬细胞，中膜结构极其紊乱且变薄，IL-1、MMP9和VEGF的表达水平较HA组更高。HA会在HA酶的作用下降解[19]，且HA引起的栓塞并不会像结扎血管那样严重损伤血管[20]，因此，HA组IL-1、MMP9及VEGF的表达水平较结扎组低。

综上所述，HA栓塞后会引起IL-1、MMP9和VEGF表达升高，损伤动脉壁正常结构，但较完全阻断血流引起的栓塞相比，程度较轻微，并不会在栓塞的基础上进一步加重血管结构重塑。本实验的不足之处是仅能确定HA引起的栓塞会引起IL-1、MMP9和VEGF表达升高和动脉壁重塑，但不能确定HA是否参与了这个过程，HA是否会引起动脉壁重塑，或在栓塞时保护血管免受重塑，其机制仍需进一步研究。

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收稿日期：2023-11-17 编辑：扶田