基于网络药理学及实验验证探讨罗布麻叶-钩藤药对治疗高血压病的作用机制

李东娜，司香环，李宏佳，徐天舒，2

1. 南京中医药大学鼓楼临床医学院，江苏 南京 210008

2. 南京大学附属鼓楼医院中医科，江苏 南京 210008

高血压病的诊断标准指在未服用降压药的前提下，收缩压（SBP）≥140 mm Hg（1 mm Hg≈0.133 kPa）、舒张压（DBP）≥90 mm Hg。情绪、饮食、生活习惯等因素均会导致高血压病的发生，进而对心脏、肾脏、大血管、脑等靶器官造成损害[1]。中医学认为，高血压病归属于眩晕、头痛等范畴，风、火、痰、瘀、虚为病因，可造成肝风内动，风阳上扰。中医药辅助治疗高血压病具有减轻临床症状、增强降压效果、预防心脑血管疾病发生的作用。

罗布麻叶具有清热利水的功效，钩藤有平肝熄风的功效。两药味甘、入肝经，是治疗高血压病的常用药对。该药对可有效改善头痛、头晕症状，具有多靶点、安全有效的优势，但是罗布麻叶、钩藤治疗高血压病的作用机制有待进一步探讨。本研究从分子机制角度出发，采用网络药理学的方法，构建药物-疾病网络，分析两药之间的交叉靶点，为新药开发、临床用药提供依据。

1 资料与方法

1.1 罗布麻叶-钩藤药对化学成分及相关靶点筛选通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），检索条件设定为口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，筛选出罗布麻叶、钩藤的化学成分，并罗列出各个成分相关的靶点。

1.2 高血压病疾病靶点检索通过GeneCards 数据库（http：//www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，http：//www.omim.org/）进行疾病靶点检索，检索关键词为“hypertension”，删除重复靶点基因。

1.3 药物-疾病共同靶点筛选及韦恩图构建将药物相关靶点、疾病靶点导入Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tool/venny），进行韦恩图构建。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建借助STRING 软件，将筛选出的药物-疾病共同靶点数据导入，并下载TSV 数据文件，借助CytoScape 3.6.1软件进行分析，得到Degree 值，使用CytoHubba 插件的MCC 算法找出PPI 网络的核心基因。

1.5 基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析采用DAVID 数据库，进行GO 与KEGG 富集分析，设定标准为P值＜0.05，选定P值最小的前20 条，使用ImageGP 作图软件进行可视化分析。

1.6 分子对接验证在RCSB PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）中检索并下载高血压病靶蛋白的3D 结构，在TCMSP 数据库中检索罗布麻叶、钩藤，下载其活性成分的2D 结构。通过PyMOL 软件对高血压病的靶蛋白进行去除原配体、水分子等处理。最后将靶蛋白与分子的活性成分通过AutoDock 软件进行对接，通过PyMOL 软件将对接结果可视化。

1.7 实验验证

1.7.1 实验动物健康雄性SD 大鼠12 只，体质量（250±20）g，由上海必凯科翼生物科技有限公司提供。许可证号：SCXK（沪）2018-0006；动物质量合格证号：20180006050317。饲养环境：室温20～25 ℃，12 h 无光照/12 h 人工光照，标准饲料喂养，自由饮水。动物伦理审批号：2023AE02007。

1.7.2 药品与试剂采购赛默飞世尔生物公司生产的Rat IL-10 Uncoated ELISA Kit（货号：88-50629-88）及Servicebio 公司的Rat TNF-α ELISA Kit（GER0004）、Rat IL-1β ELISA Kit（GER0002）、Rat IL-6 ELISA Kit（GER0001）。

1.7.3 动物分组将12 只健康SD 大鼠分为空白组4 只和需要造模组8 只。

1.7.4 造模取健康SD 大鼠8 只，术前24 h 禁食，自由饮水。采用两肾一夹法建立高血压病大鼠模型。将大鼠用异氟烷吸入性麻醉后，仰卧位固定，大鼠腹部脱毛，消毒皮肤，于剑突下1.5 cm处沿腹正中线切开，于左肾门处游离肾动脉，在肾动脉下穿入无菌丝线，把直径为0.25 mm 的针灸针与肾动脉血管长轴紧贴平行放置，用无菌丝线结扎肾动脉和针灸针，然后抽出针灸针，造成单侧肾动脉狭窄[2]。术后3 d 每天腹腔注射青霉素钠预防感染，并于术后24 h 禁食、不禁水，此后自由进食和饮水。术后第2 周末测量大鼠尾动脉SBP，以SBP≥140 mm Hg 作为造模成功的标准。

1.7.5 给药方法将造模成功的8 只大鼠随机分为模型组与治疗组，每组4 只。治疗组大鼠每天1 次予按照1∶1 比例制备的罗布麻叶-钩藤药液连续灌胃2 周，给药量为10 g/kg，溶剂为纯净水。模型组与空白组给予等体积0.9%氯化钠溶液连续灌胃2 周。

1.7.6 检测指标在给药1 周、2 周后分别测量3 次大鼠SBP 并取平均值；末次给药后，将所有大鼠麻醉，剪切胸主动脉血管组织，制成切片，进行HE 染色及病理观察；以酶联免疫吸附试验法检测血清中白细胞介素（IL）-6、IL-10、IL-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α 的含量。

1.8 统计学方法实验数据使用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多样本间比较用单因素方差分析和Tukey 事后检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 罗布麻叶-钩藤药对化学成分筛选见表1。根据1.1 中的条件筛选出罗布麻叶、钩藤的有效成分总计39 个，其中罗布麻叶6 个，钩藤33 个。

表1 罗布麻叶-钩藤有效成分

2.2 罗布麻叶-钩藤药对主要化学成分相关靶点通过TCMSP 数据库，参照药物有效成分进行筛选，共得出945 个药物靶点基因，其中罗布麻叶相关靶点基因151 个，钩藤相关靶点基因794 个，其中符合标准的相关靶点基因为180 个。

2.3 高血压病疾病靶点使用GeneCards、OMIM 数据库分析，GeneCards 数据库得到高血压病靶点基因5 516 个，OMIM 数据库获取的靶点基因为69 个，除去重复基因最终获得疾病靶点基因5 550 个。

2.4 药物-疾病交集靶点韦恩图见图1。通过筛选得到药物靶点180 个、疾病靶点5 550 个，取交集得到152 个靶点，交集靶点有TNF、IL-6、IL-1β 等。

图1 药物-疾病交集靶点韦恩图

2.5 PPI 网络图见图2。利用STRING 在线分析平台，选择高置信0.700，将所得数据导入CytoScape 3.6.1 软件，构建PPI 网络，节点代表蛋白，有136 个，边表示靶点之间的相互作用关系，有1 005 条。利用CytoHubba 插件找出PPI 网络前10 位核心靶点，分别为TNF、IL-8、趋化因子配体2（CCL2）、细胞间黏附分子-1（ICAM1）、IL-1α、IL-6、IL-1β、IL-4、IL-2、IL-10。

图2 药物-疾病交集靶点PPI 网络图

2.6 GO 与KEGG 富集分析见图3。GO 富集分析获得778 条功能条目。细胞组分（BP）共有597 条，主要富集在RNA 聚合酶Ⅱ启动因子的转录正调控、凋亡过程的负调控、DNA 模板化等方面；分子功能（CC）共有59 条，主要富集在细胞外间隙、细胞质、胞外区等；生物过程（MF）共有122 条，主要富集在酶结合、蛋白质结合、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子活性等。KEGG 富集分析获得122 条通路，有TNF信号通路、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、Toll样受体（TLR）信号通路等。

图3 GO 与KEGG 富集分析

2.7 分子对接分析见图4、表2。将罗布麻叶-钩藤药对的主要活性成分槲皮素、山柰酚分别与高血压病核心靶蛋白的前4 位TNF、CCL2、IL-8 和ICAM1 进行对接，结合能均＜-2 kcal/mol，提示配体与受体均能自发性结合。

图4 罗布麻叶-钩藤药对活性成分与高血压病核心靶点对接示意图

表2 罗布麻叶-钩藤药对活性成分与高血压病交集靶点及结合能

2.8 罗布麻叶-钩藤药对对高血压病大鼠SBP 的影响见表3。干预1 周、2 周后，与同期空白组比较，模型组SBP 均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与同期模型组比较，治疗组SBP 均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表3 3 组大鼠SBP 比较（）mm Hg

表3 3 组大鼠SBP 比较（）mm Hg

注：①与空白组比较，P＜0.05；②与模型组比较，P＜0.05

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2.9 罗布麻叶-钩藤药对对大鼠胸主动脉结构的影响见图5。HE 染色图像显示，空白组大鼠胸主动脉形态正常，血管壁内膜、中膜和外膜之间结构层次清晰，中膜厚度适中，外膜与中膜边界明显；与空白组比较，模型组胸主动脉管壁内膜结构排列紊乱，中膜增厚，外膜与中膜边界模糊，部分外膜结缔组织可见炎症浸润现象；治疗组可见中膜排列较为整齐且增厚现象得到明显改善，外膜与中膜边界较为清晰，外膜结缔组织炎症浸润现象明显减少。

图5 3 组大鼠胸主动脉组织病理检查结果（HE 染色，×100，×200）

2.10 罗布麻叶-钩藤药对对大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 水平的影响见表4。干预2 周后，与空白组比较，模型组血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 水平均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，治疗组血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 水平均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表4 3 组干预2 周血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 水平比较（）pg/mL

表4 3 组干预2 周血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 水平比较（）pg/mL

注：①与空白组比较，P＜0.05；②与模型组比较，P＜0.05

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3 讨论

高血压病是脑卒中、冠心病等疾病的重要诱发因素，中医上分为肝火亢盛、阴阳两虚、痰湿壅盛及阴虚阳亢等4 种证型[3]。临床上罗布麻叶与钩藤常作为药对联合使用治疗高血压病，在改善高血压病的症状方面疗效显著。高峰等[4]以罗布麻治疗高血压病患者，结果发现罗布麻可有效降低血压，且患者头痛、心悸、耳鸣、失眠、眩晕、烦躁等临床症状得以改善。可见罗布麻具有改善高血压病患者的症状及辅助降压的功效。黄华等[5]研究发现钩藤碱影响转化生长因子（TGF）-β1/Smad 通路，并可降低AngⅡ含量，调节改善自发性高血压大鼠的心室重构，进而降低自发性高血压大鼠的血压。但对于中药治疗高血压病的作用机制并不明确。本研究基于网络药理学的研究方法，筛选出罗布麻叶-钩藤药对的主要活性成分共39 个，治疗高血压病的靶点共152 个，与高血压病相关的信号通路共122 条。

根据表1，筛选出罗布麻叶-钩藤药对的主要活性成分有β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素、钩藤碱、木犀草素等，其中山柰酚在罗布麻叶和钩藤中都存在。相关研究表明β-谷甾醇与标准抗高血压药物赖诺普利相比，对高血压病大鼠血清生化参数有更好的改善作用[6]。动物实验研究结果表明，山柰酚对心血管具有保护作用，作用机制可能是通过刺激一氧化氮合酶增加血清一氧化氮含量，舒张血管[7]。研究提示，山柰酚通过利尿作用降低血压[8]。槲皮素可以降低肾性高血压病大鼠的血压，主要是通过改变肾动脉平滑肌细胞内游离钙离子浓度降低血压[9]。还有研究指出，通过将细胞氧化还原状态调整为适应性反应或可耐受的压力条件，可发挥其对心脑血管的保护作用[10]。钩藤碱作为降压药物的活性成分主要是通过阻滞钙离子通道，实现小动脉扩张、减慢心率和降低心输出量来发挥作用[11]。木犀草素可以通过提高一氧化氮生物利用度、降低氧化应激标志物、逆转心室收缩时间（QT）和QTc 间期延长，并降低肾损伤分子-1（Kim-1）、核因子-κB（NF-κB）和心肌肌钙蛋白I（CTnI）的表达来起到降血压的作用[12]。

根据PPI 网络前10 位核心基因推测，罗布麻叶-钩藤药对对高血压病的治疗作用可能与上述靶点有关。TNF-α 是高血压病发病机制中至关重要的炎性因子，高血压病导致氧化应激的产生，TNF-α 水平明显升高[13]。肖芝秀等[14]研究表明高血压病分级越高，TNF-α 水平越高。IL-8 和CCL2 是高血压病发病过程中的重要趋化因子，相关研究发现，高血压病的发病机制与IL-8 及CCL2 有关，IL-8 及CCL2可以影响单核细胞的黏附，使其浸润血管壁[15]。ICAM-1 是免疫球蛋白家族中一种跨膜的单链糖蛋白，王绍华等[16]研究发现肾小管ICAM-1 的表达随着高血压病的进展不断增加。高血压病患者和实验动物模型中IL-4 水平升高，研究发现其可诱导心肌内皮细胞和成纤维细胞产生MCP-1，诱导心肌成纤维细胞中活性氧（ROS）介导的转录因子激活蛋白（AP）1和胶原-1 的表达[17]。

通过KEGG 富集分析得出TNF、HIF-1、TLR、T 细胞受体等多种通路。研究表明，抑制TNF 信号通路可实现肺动脉高压大鼠炎症抑制目的[18]。HIF 属于一组转录因子，可在转录水平上介导细胞对缺氧的大部分反应，HIF-α 信号在炎症的启动或调节中起着关键作用。HIF-α 信号参与组织重塑过程，有可能成为高血压病新的治疗靶点[19]。金晨等[20]发现TLR-4和高血压病的发展密切相关，通过肾素-血管紧张素（RAS）系统激活和血管功能障碍、血管重塑，参与高血压病的发生、发展。Yang T 等[21]观察到自发性高血压病大鼠结肠上皮中T 细胞受体信号通路受到抑制，结肠上皮细胞的功能变化可能与高血压病的发病有关。

本研究结果显示，经过2 周的连续给药，与模型组比较，治疗组的SBP 降低，胸主动脉可见中膜排列较为整齐且增厚现象得到明显改善，外膜与中膜边界较为清晰，外膜结缔组织炎症浸润现象明显减少，其血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 水平均降低（P＜0.05），提示罗布麻叶-钩藤药对能有效且稳定地降低高血压病大鼠的血压。这可能与罗布麻叶-钩藤药对能够调节TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 的表达量有关。由此可推测，罗布麻叶-钩藤药对可通过抑制TNF 信号通路降低血压。

综上所述，基于网络药理学的方法对罗布麻叶-钩藤药对治疗高血压病的机制进行系统分析，发现罗布麻叶-钩藤药对主要的活性成分作用于TNF、HIF-1 等信号通路，通过氧化应激、血管重塑、炎症反应等过程发挥降压作用，证明了罗布麻叶-钩藤治疗高血压病多通路协同作用的特点。