银翘解毒片(胶囊)中灰毡毛忍冬皂苷乙的检查研究*

黄招光 薛 阳 周云峰 杨建冬 黄炳泉△

金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb)的干燥花蕾或带初开的花,山银花为忍冬科植物红腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq)、灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.-Mazz)、黄褐毛忍冬(Lonicera fulvoto-mentosa Hsu et S.C.Cheng)、华南忍冬(Lonicera confusa DC)的干燥花蕾或带初开的花,两者均具有清热解毒,疏散风热的功效,均收载于2020年版《中华人民共和国药典·一部》[1-3]。但由于市面上山银花的价格比金银花低,有部分企业为节约成本会将山银花掺伪甚至冒充金银花进行投料生产[4-7],这将阻碍中医药产业的健康发展。据报道,山银花含有灰毡毛忍冬皂苷乙成分,而金银花并不含有[8],可通过测定该成分区分两者的差异。银翘解毒片(胶囊)由金银花、连翘、薄荷、荆芥、淡豆豉、牛蒡子(炒)、桔梗、淡竹叶、甘草9味中药组成,具有疏风解表、清热解毒的作用,可用于风热感冒引起的发热头痛、咳嗽口干、咽喉疼痛等症[9,10]。为考察银翘解毒片(胶囊)中金银花的投料情况,该研究采用 TLC、HPLC、UPLC-MS/MS法建立了银翘解毒片(胶囊)中灰毡毛忍冬皂苷乙的检查方法,报道如下。

1 仪器与材料

Waters Acquity Uplc H-class/xevo TQD液相色谱质谱联用仪(美国waters公司);Agilent 1260II高效液相色谱仪(配置蒸发光散射检测器,美国Agilent公司);CAMAG双波长紫外观察箱(瑞士卡玛公司);KH-250DB超声仪(昆山禾创超声仪器有限公司);DK-S26型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)。

银翘解毒片(胶囊)(31批,其他信息见表1);缺金银花的阴性样品(实验室自制);灰毡毛忍冬皂苷乙(批号:111814-202106,含量:96.1%)、金银花对照药材(批号:121060-201608)、山银花对照药材(批号:121595-201202)来自中国食品药品检定研究院;硅胶G薄层板(批号:2021-10-09,烟台市化学工业研究所);乙醇、硫酸、三氯甲烷、甲醇(TLC)、氨水、正丁醇为分析纯,乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯,水为一级纯化水。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 TLC检查供试品溶液的制备:取本品5片,研细,加水50 ml使溶解,离心,取上清液,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次30 ml,合并正丁醇液,用氨试液洗涤2次,每次30 ml,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇2 ml使溶解,作为供试品溶液。对照品溶液的制品:取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品,加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液,作为对照品溶液。薄层色谱法试验,吸取供试品溶液 5～10 μl、对照品溶液各 5 μl,分别点于同一硅胶G 薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(14∶10∶2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果:供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,初筛有3批样品可能存在山银花掺伪投料的情况。

2.2 HPLC检查色谱条件: 采用Agilent ZORBAX SBC18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),以甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B)为流动相(梯度洗脱:0～2 min,90%B～90%B;2～8 min,90%B～30%B;8～13 min,30%B～30%B;13～15 min,30%B～10%B;15～20 min,10%B～10%B;20～21 min,10%B～90%B;21～28 min,90%B～90%B),采用蒸发光散射检测器,流速为1 ml/min, 柱温为 35 ℃。对照品溶液的制备:取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 ml中约含0.1 mg的溶液,摇匀,即得。供试品溶液的制备:取本品10片,研细,取约5 g,置100 ml具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 ml,称重,超声30 min,放冷,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。取对照品溶液和供试品溶液各20 μl,注入高效液相色谱仪,记录色谱图。见图1。结果显示,疑似阳性样品溶液的色谱图中出现与对照品保留时间一致的色谱峰,共有4批样品出现该色谱峰。

注:A 对照品;B 疑似阳性样品溶液。图1 HPLC色谱图

注:A 阴性样品;B 正常样品;C 金银花对照药材;D 山银花对照药材;E 灰毡毛忍冬皂苷乙对照品;F 阳性样品。图2 HPLC色谱图

2.3 UPLC-MS/MS确证对上述样品采用 HPLC-MS/MS法进行确认。检测条件:ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(1.8 μm,50 mm×2.1 mm);乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)为流动相,流速:0.3 ml/min,梯度洗脱(0～2 min,95%B～95%B;2～5 min,95%B～25%B;5～7 min,25%B～25%B;7～9 min,25%B～95%B;9～12 min,95%B～95%B);柱温:35 ℃;进样量:5 μl;脱溶剂气流量1000 L/h,锥孔气流量50 L/h,脱溶剂气温度 600 ℃,监测模式MRM、Daughter scan,负离子扫描,检测离子对m/z 1397.5→1074.5、m/z 1397.5→603.2和m/z 1397.5→471.3。对照品溶液:取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 ml含1.9528 μg 的溶液;供试品溶液:取本品细粉约0.5 g,置100 ml具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 ml,称重,超声30 min,放冷,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得;取金银花对照药材0.2 g、山银花对照药材0.2 g、缺金银花的阴性样品0.5 g按供试品溶液的制备方法同法制备溶液。见图2。金银花对照药材溶液、缺金银花的阴性样品溶液和正常样品溶液的色谱图中均未出现与灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液保留时间一致的离子流色谱峰,而山银花对照药材溶液、阳性样品溶液的色谱图中出现与对照品保留时间一致的色谱峰,且离子丰度比均一致,说明灰毡毛忍冬皂苷乙为山银花的特征性成分,金银花药味并不含有。通过验证,确有4批样品检出灰毡毛忍冬皂苷乙成分,批号分别为220601、210802、400326、BB04003。

3 讨论

目前金银花中药材和饮片中混有山银花的现象已较少见,但根据中国食品药品检定研究院发布的中成药质量分析报告可知,有不少含有金银花的中药制剂检出山银花特征成分灰毡毛忍冬皂苷乙[11,12],提示有部分企业会使用混有山银花的金银花原料进行违规生产,这有必要加强对含有金银花药味的中药制剂的监管力度。该研究采用TLC、HPLC-ELSD、UPLC-MS/MS法对银翘解毒片(胶囊)中金银花的投料情况进行考察,发现HPLC-ELSD、UPLC-MS/MS法检出灰毡毛忍冬皂苷乙的样品批数高于TLC法,这可能与方法的灵敏度不一有关。共有3家企业4批次样品检出山银花成分,说明这些企业的金银花原料可能存在质量问题,存在山银花掺伪的风险。现行的银翘解毒片(胶囊)标准[1]不能有效反映金银花投料的具体情况,对误用或掺杂山银花投料不能得到有效监督与控制,研究建立的灰毡毛忍冬皂苷乙检查方法能准确甄别金银花投料是否掺有山银花,对全面控制该药的质量具有重要意义。