陆生蔬菜浮床对富营养化水体氮磷的去除以及水体、根系细菌群落分析

2024-01-30周佳林段婧婧陈小锋薛利红扬州大学环境科学与工程学院江苏扬州5009江苏省农业科学院农业资源与环境研究所江苏省食品质量安全重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地江苏南京004

生态与农村环境学报 2024年1期

周佳林,段婧婧,王宁,李明,陈小锋,薛利红〔.扬州大学环境科学与工程学院,江苏扬州 5009;.江苏省农业科学院农业资源与环境研究所/江苏省食品质量安全重点实验室(省部共建国家重点实验室培育基地),江苏南京 004〕

城市化导致湖泊氮、磷富集,造成湖泊水体富营养化,且富营养化水体会危害人体健康和破坏生态环境。生态环境部发布的2022年《第二季度和1—6月全国地表水环境质量状况》中指出,在194个监测湖泊中,中度富营养12个,占6.2%;轻度富营养37个,占19.1%;其余湖(库)为中营养或贫营养状态[1]。因此,现阶段针对中度富营养及以下程度富营养水体的修复十分重要。

生态浮床主要用于富营养化水体的原位修复,因其具有成本低廉、应用广泛和便于管理维护的特点而备受欢迎[2]。生态浮床的主要机理是运用植株生长对营养元素的吸收作用以及植株根系富集的微生物代谢作用,达到去除水体中污染物质的目的。植株选择对生态浮床系统的净化效果至关重要[3]。传统的浮床植物常选用水生植株[4]。陆生植株根系发达,较水生植株更耐污,且化感作用更强,能够抑制藻类生长[5-6]。WANG等[7]提出陆生植物也可以作为浮床植物的观点。研究[8-9]表明,陆生植株在人工湿地系统中能够正常生长,且对氮、磷物质具有较好的去除效果。因此,应用陆生植株作为浮床植物净化水质,有很好的发展前景。

微生物群落可反映水生态系统化学循环过程,并与水体水质情况具有一定联系[10]。16S rDNA高通量测序和定量 PCR(qPCR)相结合的技术是较为常用的水体微生物群落结构和功能基因的测试手段[11]。本地生长的蔬菜、花卉对周边环境适应性强,不存在物种入侵风险,且兼具经济效益和景观性。同时,陆生蔬菜具有丰富的根系微生物群落,但在水环境中培育时,陆生蔬菜对水体环境的适应性和根系表面微生物的影响尚不清楚。因此,根据地域特点,挑选江浙一带较为常见、易于水培的陆生蔬菜青菜和生菜,利用高通量及功能基因结合手段,探究陆生蔬菜浮床体系对富营养化水体氮、磷净化效果以及对根系微生物群落结构和反硝化作用的影响。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验采用160 L水箱(上部770 mm×560 mm,底部630 mm×430 mm,高460 mm)和管径为10 mm的PVC管(35 mm×45 mm)定制浮床框架,在其上铺渔网,加定植篮筐(25 mm×31 mm×45 mm)12个作为浮床植株的载体。试验装置见图1。

图1 试验装置Fig.1 Experimental installation diagram

试验水体来源于江苏省农业科学院水塘,初始水质指标:ρ(TN)为5.1 mg·L-1,ρ(TP)为0.1 mg·L-1,ρ(NH4+)为0.2 mg·L-1,ρ(NO3-)为2.3 mg·L-1,pH为9.03,ρ(DO)为16.3 mg·L-1,电导率(SPC)为362.8 μS·cm-1,用纯水稀释3倍将水体ρ(TN)和ρ(TP)调节至约1.5和0.05 mg·L-1。从市场购买江浙一带具有耐寒性的常见蔬菜青菜、水芹和生菜用于开展后续试验。

1.2 试验方法

试验前洗净根部蔬菜,在试验水体(120 L)中预培养14 d,待稳定后,正式开始植株试验。正式试验于2022年4月20至5月3日进行。设3个处理组和1个对照组,每组设3个重复。试验分为2个阶段,试验第1～6天为第1阶段,第7～13天为第2阶段。试验期间,分别于试验1、3、5、7、9、11和13 d时取样,每次取样前补充一定量的纯净水至初始刻度,防止蒸发造成的影响。从3 d时开始,每2 d补充一次营养盐,TN和TP补充量分别为0.2和0.012 mg·L-1。

1.2.1植株样本的采集

试验前后称量植株鲜重,且试验前每个处理另取与之相同鲜重的植株,用于得到试验前干重和体内营养物质背景值。将烘干的植株样磨碎、过筛,并于105 ℃条件下杀青30 min,于60 ℃烘箱烘干至恒重。称取干重为0.1～0.2 g植株用于体内全氮、全磷的测定。试验后测量根系长度。

1.2.2水样的采集

采用五点法取100 mL水样用于营养盐的测定。

1.2.3根系水体及根系微生物的采集

用无菌针头于试验1(前期)、7(中期)和13 d(后期)时抽取根系附近水体90 mL,用无菌0.22 μm孔径滤膜抽滤后,放入2 mL无菌离心管中,存于-80 ℃冰箱中。试验结束后用无菌剪刀取植株根系5 g(鲜重),将无菌水冲洗后的根系置于装有0.1 mol·L-1PBS缓冲液的50 mL无菌离心管中,超声洗涤10 min,再用0.22 μm滤膜抽滤、保存,用于微生物反硝化功能基因和细菌群落多样性的测定。

1.3 试验指标的测定

1.3.1植株氮、磷的测定

植株体内总氮浓度经H2SO4-H2O2消煮,采用凯氏定氮仪测定。总磷浓度经H2SO4-H2O2消煮,采用电感耦合等离子光谱发射仪(ICP)测定。

1.3.2水质指标的测定

pH、水温、溶解氧(DO)浓度、电导率(SPC)等水质指标采用便携式水质检测仪原位测定。水体总氮浓度采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(HJ 636—2012《水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》)测定,总磷浓度采用钼酸铵分光光度法(GB/T 11893—1989《水质总磷的测定钼酸铵分光光度法》)测定,氨态氮浓度采用紫外分光光度法测定,硝态氮浓度采用靛酚蓝比色法测定。

1.3.3DNA提取与PCR扩增

微生物基因委托北京奥维森基因科技有限公司测定。测定方法:使用超纯总DNA提取试剂盒进行DNA提取,对微生物进行PCR扩增,扩增引物为ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和GGACTACHVGGGTWTCTAAT,扩增区间为V3～V4区。nirK、nirS、nosZ和norB功能基因Real Time PCR检测引物为nirK(FlaCu-R3Cua):上游引物为ATCATGGTSCTGCCGCG,下游引物为GCCTCGATCAGRTTGTGGTT;nirS(cd3a-R3cd):上游引物为GTSAACGTSAAGGARACSGG,下游引物为GASTTCGGRTGSGTCTTGA;nosZ:上游引物为CGYTGTTCMTCGACAGCCAG,下游引物为CGSACCTTSTTGCCSTYGCG;norB:上游引物为GGNCAYCARGGNTAYGA,下游引物为ACCCANAGRTGNACNACCCACCA。

PCR扩增条件为94 ℃(5 min)预变性后,94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共30个循环,最后72 ℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果。将合格PCR产物按照样本测序量要求进行相应比例的混合,采用MiSeq测序仪进行高通量测序分析。

1.4 指标计算

(1)植株相对生长速率(RGR)的计算

(1)

式(1)中,Wt为t时间植株干重,g;Wt+1为t+1时间植株干重,g;t为实验培养时间,d;RRG为植株相对生长速率,g·g-1·d-1;

(2)N、P污染负荷去除率的计算

(2)

式(2)中,C0为N或P营养盐添加浓度,mg·L-1;Ci为N或P初始浓度,mg·L-1;Cj为N或P最终浓度,mg·L-1;n为N或P营养盐添加次数;V0为初始水体体积,L;V为添加营养盐后水体体积,L;w为N或P污染负荷去除率,%;

1.5 数据处理

试验数据采用SPSS 26.0进行描述和方差分析,采用Duncan法进行差异显著性分析(P<0.05),采用Origin 2021制图;功能基因和环境因子相关性分析采用皮尔逊相关性分析(P<0.05,P<0.01)。MiSeq测序得到的PE reads序列首先根据overlap关系进行拼接,同时进行质控和过滤序列质量,区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析,基于OTU聚类分析结果,计算α多样性〔Chao1、覆盖率(observed_species)、Shannon、Simpson〕。α多样性、β多样性和偏最小二乘辨别分析(PLS-DA)聚类计算均使用QIIME流程,采用R语言绘图。

2 结果与分析

2.1 植株生物量和根系变化

3种植株试验前后生物量变化情况见表1,其中,青菜生物量增加量最大,平均增重57.477 g;水芹次之,平均增重55.500 g;生菜增加量最小,平均增重14.743 g。试验后水芹处理组鲜重与生菜处理组呈显著差异(P<0.05)。植株相对生长速率由高到低依次为青菜、水芹和生菜,并呈显著差异(P<0.05)。而收获时水芹根系长度显著高于青菜和生菜(P<0.05)。

表1 植株物理指标Table 1 Physical indicators of plants

由表2可知,与试验前相比,试验后青菜体内全氮、全磷含量显著下降(P<0.05),水芹和生菜体内全氮含量显著下降(P<0.05),试验后各处理间无显著差异。由表3可知,青菜和生菜处理氮净去除量(75.720～81.460 mg)高于对照和水芹处理(47.360～50.320 mg),青菜处理组植株吸氮量高于水芹处理组,生菜处理组其他吸氮量最大。

表2 植株体内营养元素浓度Table 2 Concentration of nutrients in the plants

表3 各处理氮平衡分析Table 3 Analysis of nitrogen balance in the treatments

2.2 水体水质氮磷浓度变化及去除率

如图2所示,水体温度维持在16～27 ℃,以第9天为分界点呈现先下降后上升趋势。水体pH维持在9～11,并呈上升趋势,前9天对照组最高。DO浓度和SPC变化趋势相同,均以第5天为分界点呈现先下降后上升趋势。前7天水芹和青菜处理组DO浓度低于生菜和对照组,后期生菜DO浓度较其他处理组低。生菜处理组SPC一直较低,后期各处理组SPC由高到低依次为水芹、青菜、对照和生菜。

DO为溶解氧,SPC为电导率。图2 水质物理指标Fig.2 Physical indicators of water quality

2.2.1水体氮磷浓度变化及去除率

水中营养物质浓度变化分为2个阶段(图3)。如图3(a)所示,蔬菜浮床经第1阶段培养后,除水芹处理组外,青菜和生菜处理组TN浓度明显下降,蔬菜处理组TN浓度均低于对照组。进入第2阶段后,蔬菜处理组和对照组TN浓度有所累积,且对照组TN高于蔬菜处理。如图4(a)所示,在组内水平上,各组试验第1阶段TN污染负荷去除率与第2阶段无明显差异。而在组间水平上,第1阶段水芹处理组TN污染负荷去除率与生菜处理组间差异显著(P<0.05)。2个阶段TN平均负荷去除率从高到低依次为生菜(33.93%)、青菜(31.20%)、对照(24.41%)和水芹(9.05%)。

如图3(b)所示,经第1阶段培养后,蔬菜处理组水体TP浓度下降,而对照组出现TP累积现象,导致对照组TP浓度高于其他处理组。进入第2阶段后,陆生蔬菜处理组TP浓度于试验11 d时急剧累积,之后快速下降,其中,只有青菜处理组TP浓度高于对照组。如图4(b)所示,第1阶段处理组TP污染负荷去除率与对照组有显著性差异(P<0.05),且随着试验的进行,青菜和水芹处理组TP污染负荷去除率下降,生菜处理组去除率相对稳定,而对照组去除率上升。结合第1和第2阶段结果,水芹、生菜和青菜处理组TP负荷平均去除率(57.13%、46.91%和40.86%)优于对照组(25.46%)。

如图3(c)所示,经第1阶段培养后,蔬菜处理组NO3-浓度有所累积,而对照组NO3-浓度降低,各处理组水体NO3-浓度由高到低依次为生菜、对照、水芹和青菜。进入第2阶段培养后,各处理组NO3-浓度呈累积趋势,最终对照组NO3-浓度最高,生菜处理组NO3-浓度最低。如图4(c)所示,各处理组NO3-污染负荷去除率无明显差异。2个阶段NO3-负荷平均去除率由高到低依次为青菜(39.96%)、对照(39.71%)、生菜(31.19%)和水芹(30.99%)。

试验期间未添加任何形式的铵盐。如图3(d)所示,经第1阶段培养后,各处理组NH4+浓度明显下降,对照组NH4+浓度略高。进入第2阶段培养后,青菜处理组NH4+浓度有所累积,这与其他处理组变化趋势相反。试验结束时,水芹处理组NH4+浓度最低。如图4(d)所示,第2阶段青菜处理组NH4+污染负荷去除率(-36.02%)与其他处理组呈显著差异(P<0.05)。2个阶段水芹处理组(51.30%)和生菜处理组(48.16%)NH4+负荷平均去除率明显高于对照组(27.23%)和青菜处理组(5.17%)。

2.3 微生物群落结构及基因丰富度分析

2.3.1微生物群落结构

试验结果共提取23 360条有效序列,经抽平处理获得4 421个OTU。由表4可知,各处理组OTU数量在试验中期达到峰值,试验末期OTUs较初期高。

表4 各处理组OTUs数量Table 4 Details of OTUs in each process

由图5可知,试验结果表明,属水平上发现15种优势菌属,包括黄杆菌属(Flavobacterium)、栖湖菌属(Limnohabitans)、产卟啉杆菌属(Porphyrobacter)、Cyanobium_PCC-6307、芽单胞菌属(Gemmatimonas)、多核杆菌属(Polynucleobacter)、UKL13-1、嗜湖水橙色杆状菌(Sandarakinorhabdus)、红杆菌属(Rhodobacter)、噬氢菌属(Hydrogenophaga)、Schrenkiella_parvula、玫瑰单胞菌(Roseomonas)、Pseudanabaena_PCC-7429、大不里士杆菌属(Tabrizicola)和玫瑰球菌属(Roseococcus)。

Bra为青菜处理,Oja为水芹处理,Lsa为生菜处理,Ctr为对照;1、7和13表示不同采集天数水样;R表示第13天蔬菜根系。图5 属水平物种组成Fig.5 genus level species composition

黄杆菌属相对丰度在蔬菜根系明显低于蔬菜根系周围水体(P<0.05)。在试验全程,青菜、水芹处理组黄杆菌属相对丰度下降。试验结束后,蔬菜处理组黄杆菌属相对丰度低于对照组。栖湖菌属相对丰度以对照组为较大,在试验全程相对丰度呈现下降趋势,其中,试验1和7 d时对照组栖湖菌属相对丰度明显高于其他处理组(P<0.05)。产卟啉杆菌属和UKL13-1相对丰度在水芹根系周围水体中明显增加(P<0.05)。对照组多核杆菌属、嗜湖水橙色杆状菌相对丰度较高,且在试验末期明显高于其他(P<0.05)。

在试验后期青菜根系周围水体及根系表面Cyanobium_PCC-6307相对丰度高于其他处理组(P<0.05)。芽单胞菌属相对丰度在青菜根系周围水体以及水芹和生菜根系表面最高(P<0.05)。各蔬菜根系红杆菌属相对丰度明显高于根系周围水体和对照组(P<0.05)。在试验全程,对照组噬氢菌属相对丰度均明显低于其他处理组(P<0.05),且以水芹、生菜根系为最高(P<0.05)。青菜和水芹根系玫瑰单胞菌和玫瑰球菌属相对丰度明显高于根系周围水体(P<0.05)。生菜根系Pseudanabaena_PCC-7429相对丰度明显高于其他处理组(P<0.05)。试验后期,大不里士杆菌属相对丰度在青菜、水芹根系水体及根系表面明显高于其他处理组(P<0.05)。

2.3.2微生物群落丰富度和物种多样性

(1)α群落多样性

由表5可知,试验过程中水芹处理组微生物群落丰富度最高,对照组微生物群落丰富度最低。试验过程中,微生物群落丰富度于7 d时达到峰值后下降,但在试验末期各处理组微生物群落丰富度较1 d时增加。各处理组蔬菜根系微生物群落丰富度由大到小依次为水芹、生菜和青菜。Shannon和Simpson指数用来估算样本中微生物多样性,Shannon和Simpson指数值越大,说明群落多样性越高。根据Shannon和Simpson指数可知,试验初期水芹处理组微生物多样性最高,试验第7天生菜处理组物种多样性最高,试验结束时水芹处理组物种多样性最高,对照组物种多样性在试验全程均为最低。试验过程中,青菜处理组微生物多样性持续升高,水芹处理组先减少后增加,生菜处理组和对照组先升高后降低。除对照组外,试验结束时蔬菜处理组微生物群落多样性指数均比试验初期有所增加。各蔬菜根系微生物多样性由大到小依次为水芹、生菜和青菜。

表5 α多样性指数Table 5 Alpha diversity index

(2)β群落多样性

各样本间的距离表示样本间的差异性,距离越近则越相似,距离越远则差异越大。由图6(a)可知,各个根系处理组与各个水体处理组样本距离远,说明根系和水体的组成有差异,其中水芹根系处理组和青菜根系处理组的距离近,其相似度高。对照中期、生菜中期、生菜末期、水芹前期和水芹末期样本点分布分散,且离其他样本点较远。

Bra为青菜处理,Oja为水芹处理,Lsa为生菜处理,Ctr为对照。1、7和13表示不同采集天数水样;R表示第13天蔬菜根系。T为温度,DO为溶解氧,SPC为电导率,TN为总氮,TP为总磷。图6 β多样性指标偏最小二乘辨识分析(PLS-DA)和环境因子冗余分析(RDA)Fig.6 β diversity index PLS-DA and environmental factor analysis RDA

(3)微生物群落与环境因子影响因素分析

由图6(b)可知,环境因子对微生物群落的解释为68.7%。pH、NH4+和水温(T)对微生物群落的影响较为明显,黄杆菌属和栖湖菌属与NH4+、T、TN和DO呈现正相关,红杆菌属和Cyanobium_PCC-6307与pH、SPC、TP和NO3-呈现正相关。

2.3.3微生物功能基因丰度与环境因子相关性分析

(1)功能基因丰度

各处理组根系及其周围水体微生物功能基因(nirK、nirS、nosZ、和norB)拷贝数分析结果见图7。由图7(a)可知,对照组水体中nirK基因拷贝数较其他处理组高,且7 d时对照组水体中和13 d时水芹根系nirK基因拷贝数显著高于其他处理组(P<0.05)。由图7(b)可知,试验后期青菜处理组水体中nirS基因拷贝数增加较多,青菜根系表面富集nirS基因拷贝数显著低于其他处理组(P<0.05)。nosZ和norB基因拷贝数变化趋势与nirS基因相同,均呈现13 d时基因拷贝数比1 d时增加的趋势〔图7(b)～(d)〕。

同一幅图中,同一组柱子上方英文小写字母不同表示同一条件下不同处理间某指标差异显著(P<0.05)。误差线为标准误。1、7和13表示不同采集天数水样,13-R表示第13天蔬菜根系。图7 不同处理组根系及周围水体基因丰度Fig.7 Abundance of functional genes in roots and surrounding water of different vegetable treatments

(2)功能基因与环境因子相关性分析

各功能基因与环境因子的相关性分析结果见表6。nirK基因与TN、NO3-分别呈显著正相关(P<0.05)和极显著正相关(P<0.01);nirS、nosZ和norB基因仅与环境因子T呈显著相关(P<0.05);nirS、nosZ和norB基因两两之间呈极显著相关(P<0.01)。

表6 反硝化功能基因与环境因子之间皮尔逊相关性Table 6 Pearson product-moment correlation coefficient between denitrification function genes and environmental factors

3 讨论

3.1 环境参数与氮磷的变化

水质参数是评判生态环境是否健康的重要特征指标。试验水体初始pH呈碱性(图2),水体中有藻类和浮游动物存在,推测水中藻类的光合作用导致pH过高[12]。在试验前期,水体pH有所下降,这可能是由于在试验初期微生物硝化作用活跃,产生大量H+,使水体pH降低[13]。同时,根据皮尔逊相关性分析结果(表6)可知,高pH可以降低水中NH4+浓度,这与化学平衡结果一致。水体DO浓度呈现先下降后上升趋势(图2),这是由于水体DO浓度与空气中氧气和藻类光合作用有关,温度骤降会导致DO浓度突然下降[14]。同时,微生物迅速增长也会导致水体DO浓度下降。随着试验的进行,水体微生物代谢水平相对稳定,植株根系泌氧功能增强,导致DO浓度回升[15]。

大量研究表明,N、P循环主要包括3个部分:外界环境、底泥释放、大气沉降和生物固氮等途径的源过程;植物吸收、反硝化等途径的去除过程;生物吸收和排泄、硝化作用、微生物分解等途径的迁移和转化过程[16-17]。蔬菜浮床对水体N净化能力有差异,这是由于植株本身生理特性差异造成的。陆生蔬菜的青菜、生菜对TN的去除效果明显好于水芹(P<0.05),造成这一现象的原因可能是由于陆生蔬菜在水培时,由于生存环境改变,陆生蔬菜急需大量营养元素,而水芹作为湿生植物在水体中适宜性较强。所需营养元素含量不同导致青菜和生菜对TN的去除效果较好。与此同时,在低营养水体环境中,植株为了维持自身生命体征,当水中营养盐不能满足代谢要求时,植株消耗体内营养物质导致体内营养盐含量下降。

除此之外,植株根系泌氧是影响水体中氮去除的重要因素。根系泌氧功能主要通过改善脱氮微生物生存环境、影响脱氮微生物群落结构与活性、维持硝化反应所需的好氧环境等方式,从而起到促进脱氮的效果[18]。此外,植物在生长过程中,会分泌根系分泌物,为浮床系统提供内在碳源[19]。邓泓等[20]通过研究10种湿地植株根系泌氧特征,发现水芹根部任意部位均具有较高的泌氧速率,其根部存在发达的通气组织。嵇庆才等[21]发现水稻在土培、水培中生物形态有所不同,土培会促进叶片生长,而水培会促进根系生长。笔者研究结果表明,水芹根系茂盛、长且粗大,青菜和生菜根系长度相差不大,其中,生菜须根多,根表面积较大,这可能是生菜生物量较小但其根系微生物丰度较高的原因。这说明陆生植株水培后会促进其根部生长,根系泌氧功能在一定程度上会得到增强,从而提高其脱氮能力。试验后期植株生长状态相对稳定,N、P吸收能力有所下降。对照组在试验前期对NH4+去除能力较好,这可能与藻类生长和微生物代谢有关[22]。因此,陆生蔬菜的青菜、生菜通过植物吸收和改变微生物丰度作为氮素去除的主要方式,整体脱氮效果与水芹相当。

3.2 蔬菜浮床对微生物物种多样性的影响

笔者试验中黄杆菌属(Flavobacterium)、栖湖菌属(Limnohabitans)、芽单胞菌属(Gemmatimonas)、红杆菌属(Rhodobacter)和噬氢菌属(Hydrogenophaga)等属为优势物种,具有较高的丰度(>0.08%),且能够参与氮转化过程。

硝化作用是去除水中NH4+的重要途径,研究发现栖湖菌属在淡水系统广泛分布,具有可以代谢多种底物的能力,部分菌种具有二氧化碳固定作用、光合作用和氨氧化等多种代谢功能[18]。对照组水体中栖湖菌属相对丰度在试验前期较高,且其去除NH4+的效果较好;在试验开展后其相对丰度明显下降(P<0.05),水体NH4+的去除能力也明显下降。这与刘明坤[23]发现NH4+与栖湖菌属呈正相关的结论一致。在试验后期对照组水体NH4+浓度较高可能与硝酸盐异化还原为氨有关[24]。而在试验初期和后期蔬菜浮床处理水体栖湖菌属相对丰度较低,但对NH4+的去除效果较好,这说明蔬菜浮床系统的脱氮方式较为多样且可以抑制硝酸盐异化还原为氨的过程。

研究[25-29]发现,黄杆菌属、红杆菌属和噬氢菌属都属于典型的反硝化菌属,其中,黄杆菌属具有厌氧硝化、好氧反硝化的作用。LIU等[30]在曝气滤池中发现了氮氧化菌类的黄杆菌属具有较高丰度。笔者试验结果表明,对照无蔬菜处理组黄杆菌属相对丰度较高,对TN、NO3-的去除效果较好。同时,各处理组水体中黄杆菌属相对丰度较高。红杆菌属对氮、磷及有机物具有较好的去除效果[28],笔者试验结果表明其丰度在陆生蔬菜根系表面和水芹根系周围水体中较高,且对NO3-的去除效果较好。这说明蔬菜浮床可以利用水体中黄杆菌属和蔬菜根系表面的红杆菌属进行反硝化脱氮。

其次,在净化低污染水体、富营养化湖泊和人工湿地过程中,由于低C/N比对反硝化过程具有限制作用,水体会出现许多自养反硝化过程(硫自养反硝化、铁自养反硝化和氢自养反硝化)[31]。其中,氢自养反硝化过程主要消耗H2和NO3-。GAO等[32]在低C/N比(C/N比为2∶1)条件下,通过电解强化手段将人工湿地中噬氢菌属相对丰度从6.0%提升至24.3%。说明富营养化水体在缺少碳源条件下,水中H2可被用作电子供体,使噬氢菌属以氢自养方式进行反硝化。笔者试验也发现,在水芹和生菜根系表面具有氢自养功能的噬氢菌属相对丰度(分别为5.67%和5.73%)显著高于其他菌属(P<0.05)。此外,许多水体和土壤环境也均发现芽单胞菌属的存在。ZHANG等[33]从芽单胞菌属中检测出与反硝化和碳固定相关的基因。芽单胞菌属携带nosZ基因,可以通过反硝化作用减少N2O,将N2O转化为N2[34]。笔者试验中芽单胞菌属主要分布于水芹、生菜根系表面,通过反硝化作用将N2O转化为N2。笔者试验结果表明生菜根系微生物丰富,这说明生菜浮床不仅能够通过显著增加氢自养反硝化的方式来脱氮,还可以实现完全反硝化以减少温室气体的产生。

3.3 浮床蔬菜对反硝化微生物的影响

水体中反硝化作用主要是NO3-经硝酸盐还原酶(nitrate reductase,Nar)催化为NO2-,其次经亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,Nir)催化成NO,再次经氧化氮还原酶(nitric oxide reductase,Nor)催化成N2O,最后经氧化亚氮还原酶(nitrous oxide reductase,Nos)催化成N2的过程[35]。nirK基因的催化过程是将亚硝酸盐转化为氧化氮,这是反硝化作用有别于其他硝酸盐代谢的标志性反应,该基因编码的亚硝酸盐还原酶是催化该反应的限速酶,nirK和nirS基因编码催化产物是NO和N2O混合物[36]。

笔者研究结果表明,各处理组nirK基因拷贝数是nirS基因的10倍以上,这是由于nirK基因更多存在于细菌中,且两者不能共存[37]。对照组nirK基因处于优势,这对硝酸盐降解起到一定作用,这与对照组NO3-的去除结果保持一致。其次,在试验后期,水芹和生菜根系表面nirK基因丰度远高于各自周围水体。这表明水芹、生菜根系表面会聚集nirK基因,使反硝化微生物大量繁殖,以此来增强对NO3-的去除。笔者试验结果还显示,水芹和生菜根系表面nirS和norB基因丰度较高,而青菜根系周围水体中这两个基因丰度较高,这说明不同于水芹和生菜浮床系统,青菜浮床系统主要依赖于水体中具有反硝化功能的基因来促进反硝化过程。

nosZ基因可以将N2O催化成N2后排放出去,这是减少温室气体排放的关键步骤。而在某些含有nir和nor基因的细菌和古菌中,往往缺失nos基因,使得反硝化过程终产物为N2O[34]。此外,研究[38]发现,nirS型反硝化菌往往携带nosZ基因(CupriaviduseutrophaJMP134除外),这可能是nosZ与nirS基因变化趋势相同但其相对丰度较小的原因。笔者试验中,在青菜根系周围水体以及水芹和生菜根系表面都发现较高相对丰度的nosZ基因,这说明蔬菜浮床系统有利于进行完整的反硝化过程,从而有效减少水体中温室气体的产生。