堆肥低温启动菌剂的研制与效果评价

2024-01-30杨明珠许欢欢郭传旭夏燕维缪有志郑树林张瑞福江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室南京农业大学资源与环境科学学院江苏南京0095菏泽金正大生态工程有限公司山东菏泽70000

生态与农村环境学报 2024年1期

杨明珠,许欢欢,郭传旭,夏燕维,缪有志,郑树林,张瑞福① (.江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室/南京农业大学资源与环境科学学院,江苏南京 0095;.菏泽金正大生态工程有限公司,山东菏泽 70000)

农业固体废弃物指农业生产加工过程中产生的固体废弃物,包括作物秸秆和畜禽粪便等,主要由糖类、蛋白质、氨基酸、无机盐、淀粉和纤维素等组成,是重要的可再生资源[1-2]。我国农业固体废弃物年产量已达50亿t以上[3],其中,畜禽粪便综合利用率不足60%[4]。废弃物大量堆积,不但造成资源浪费,而且对生态环境造成严重污染。

好氧堆肥是农业废弃物资源化利用的有效途径之一,可实现资源化再利用[5]。温度是影响堆肥进程的重要参数之一[6],起爆阶段指堆体温度经历的一个环境温度升高的阶段,这一阶段对于微生物大量繁殖及启动堆肥反应有着重要意义[7-8]。在我国冬季,尤其是北方地区,持续低温长达4～6个月,这段时间内堆肥反应启动困难,堆肥周期长,病原微生物难以有效杀灭,大大降低了堆肥效率,限制了堆肥技术的应用推广。

迄今为止,关于堆肥低温微生物菌剂的研究多聚焦于低温纤维素菌的筛选应用。然而,堆肥过程中木质纤维素等物质主要在高温期被降解利用,此时接种的低温菌大多已经因为高温而休眠,甚至失活。适冷微生物凭借独特的适低温机制能够在寒冷环境中正常生长代谢,在0～20 ℃之间仍具有较高活性[9],与冬季堆肥的环境温度大致相同。接种适冷菌将加快低温条件下堆肥的起爆过程。已有研究表明在堆肥中接种微生物菌剂,可以有效增加堆体中活菌数,加速有机物的分解[10]。SUN等[11]利用在低温鸡粪反应堆中筛选得到的节杆菌、嗜冷杆菌和肺炎杆菌构建低温复合菌剂并将其应用于低温鸡粪堆肥中,表明适冷微生物可以通过改变鸡粪堆肥菌群结构和提高相关酶活性来促进堆肥快速升温。

因此,笔者研究侧重于选择能在堆肥初期分解蛋白、淀粉等小分子碳氮源的功能菌,复配低温堆肥复合微生物菌剂。该研究选择4株分离于南极土壤中的菌株,对其低温生长条件和产酶特性进行测定,根据测定结果选择其中3株复配复合菌剂,并进一步在实验室条件下评估菌剂低温堆肥起爆效果。最终,将复合菌剂应用于有机肥厂冬季鸡粪堆肥生产中,并将其与市售堆肥菌剂进行对比,探究添加复合菌剂对堆肥起爆及腐熟效果的影响,以期为低温条件下农业固体废弃物堆肥提供技术和产品支撑。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

从中国典型培养物保藏中心(CCTCC)检索获得4株分离自南极、具有低温产酶能力的候选菌株:边缘假单胞菌MP-1(Pseudomonasmarginalis)、蜡样芽孢杆菌BC-2(Bacilluscereus)、硬结节杆菌AS-3(Arthrobacterscleromae)和水稻节杆菌AO-4(Arthrobacteroryzae),这4个菌株最低培养温度均为4 ℃。以市售堆肥接种剂(主要包含酵母菌和乳酸菌)作为对照。

1.2 候选菌株生长特性分析

根据堆肥起爆阶段微生物主要利用物料中小分子有机物质的特点,以低温生长、产酶和堆肥原料浸出物利用能力为标准对菌株进行评价。

(1)菌株最适生长温度。在150 mL三角瓶中添加25 mL LB液体培养基,按照体积分数为1%分别接种D600=1条件下的4株菌的菌悬液,摇床设置不同温度(5～35 ℃,每5 ℃为1个梯度),按170 r·min-1振荡培养过夜(12 h),测定菌株在600 nm波长处光密度(D600),通过D600值确定菌株最适生长温度。

(2)菌株酸碱、盐浓度适应性。在150 mL三角瓶中加入25 mL LB 液体培养基,培养基调节成不同pH(4～9,每0.5为1个梯度),按照体积分数为1%分别接种D600为1的4株菌的菌悬液。调节培养基NaCl质量分数为0～4%测定盐胁迫适应性。于摇床25 ℃、170 r·min-1条件下振荡培养过夜(12 h),测定菌株D600值。

(3)菌株15 ℃生长曲线。采用Bioscreen C 生长曲线仪测定菌株在15 ℃条件下生长曲线。首先,将4株菌分别培养至D600为1情形下,吸取100 μL菌悬液于2 mL无菌离心管中,按3 000 r·min-1离心5 min后用无菌水清洗菌体2次,然后用LB液体培养基定容至2 mL。吸取200 μL菌液至孔板中,每个菌株10个孔,将孔板置于生长曲线仪中进行生长曲线测定。

1.3 菌株产蛋白酶特性测定

蛋白酶活性指在一定温度和pH条件下,每分钟水解酪蛋白生产1 mg酪氨酸所需酶的量,将其定义为1个酶活单位(U)。蛋白酶活性测定采用福林酚法[12]。

发酵时间对菌株产蛋白酶的影响。将菌株在LB液体培养基中培养至D600为1情形下,然后按照体积分数为1%的接种量将菌悬液接种于发酵培养基中,在25 ℃、170 r·min-1条件下培养48 h,每隔6 h取1次样品,测定蛋白酶活性。

温度对菌株产蛋白酶活性的影响。将菌株分别按照体积分数为1%的接种量接种于发酵培养基中,设置系列温度梯度为5～40 ℃(每5 ℃为1个梯度)按170 r·min-1培养24 h,然后于40 ℃条件下测定蛋白酶活性。

菌株产蛋白酶的最适反应温度。将粗酶液与酪蛋白混合后置于不同温度(5～30 ℃区间,以每5 ℃ 为1个梯度)条件下反应10 min;然后于相应的反应温度条件下测定蛋白酶活性。

1.4 堆肥起爆复合菌剂的制备

根据候选菌株的性状评价情况,选取边缘假单胞菌MP-1、硬结节杆菌AS-3和水稻节杆菌AO-4按照2∶1∶1混合复配复合菌液(IM复合菌剂),接种前确保有效活菌数≥109cfu·mL-1。

1.5 起爆复合菌剂利用堆肥原料浸提液的生长试验

供试鸡粪堆肥原料由浙江原起生态科技有限公司提供,茶粕堆肥原料由湖南益阳某有机肥厂提供,中药渣堆肥原料由姜堰禾喜生物科技有限公司提供。将800 g物料与20 L水混合,浸泡12 h,先用纱布过滤固体物质,再采用贝德曼离心机按 10 000 r·min-1离心10 min,取滤液进行抽滤,最后,用0.22 μm孔径水系无菌滤膜过滤3次,直至滤液涂布无菌。用无菌水将各菌液中菌落数调节一致,均为106cfu·mL-1,按照体积分数为1%接种量将其接种于50 mL浸提液中,于15 ℃、170 r·min-1条件下发酵24 h。试验设置鸡粪浸提液处理(JF)、中药渣浸提液处理(ZYZ)和茶粕浸提液处理(CP),分别设置不接菌处理为对照,计数菌株生长量,每个处理设置3个重复。

1.6 堆肥低温起爆复合菌剂的冬季鸡粪堆肥试验

堆肥试验时间为2021年12月至2022年1月,在浙江原起生态科技有限公司建德有机肥生产基地进行。以鸡粪木屑混合物进行堆肥(表1),将堆肥原料起始质量含水率调至65%,C/N比值为(35～40)∶1,温度为冬季自然气温,堆体长×宽×高为9 m×5 m×1.3 m。试验设置接种堆肥低温起爆复合菌剂(IM)和对照(control,接种市售常规堆肥菌剂)2个处理。复合菌剂先用秸秆粉末吸附,再按照3.5‰质量比分层铺匀接种。

表1 堆肥原料基本理化性质Table 1 Basic physical and chemical properties of compost raw materials

1.7 低温堆肥理化性质的测定

1.7.1堆体温度测定及样品采集

在每天9:00和14:00,采用金属温度计测定堆体上(10～20 cm)、中(50～60 cm)和下层(90～100 cm)温度,每层随机测定5个点,同时记录当天两个时间点环境温度,取平均温度作为堆体温度。采用上、中、下多高度剖面等量取样法,将样品混合均匀,用四分法最终保留1.5 kg。一部分样品自然风干,参照NY 525—2022《有机肥料》粉碎过筛[13];一部分保存在4 ℃冰箱中用于后续分析。

1.7.2含水率和pH的测定

采用105 ℃烘干法测定新鲜样品含水率。按照m(新鲜样品)∶V(去离子水)=1∶10比例混合后,将混合物放置在水平摇床上振荡2 h,静置20 min,用pH计测定pH。每个样品重复测定3次,取平均值。

1.7.3全碳(TC)、全氮(TN)含量和碳氮比的测定

对于风干、粉碎后过15 mm孔径筛的堆肥样品,准确称取10～11 mg,装入石英干烧管内,采用碳、氮元素自动分析仪(Vario EL,Germany)测定全氮和全碳含量。试验所测碳氮比由全碳、全氮含量测定结果计算得出。每个样品重复测定3次后取平均值。

1.7.4全磷(TP)和全钾(TK)含量的测定

将样品进行风干、粉碎处理并过0.85 mm孔径筛后,使用浓H2SO4-H2O2消煮,采用Agilent710 ICP-OES电感耦合等离子体原子发射光谱仪测定全磷含量(n1,%)和全钾含量(n2,%)。n1=0.5X1×100/M,n2=0.5X2×100/M,其中,M为样品质量,g;X1和X2为对应仪器测得数值。

1.7.5铵态氮和硝态氮含量的测定

按照m(新鲜样品)∶V(去离子水)=1∶10比例混匀后,于摇床振荡24 h后,离心取上清液过0.45 μm孔径水系滤膜,用连续流动分析仪Auto Analyzer 3测定,每个样品重复测定3次,取平均值。

1.7.6种子发芽指数(GI)的测定

按照m(新鲜样品)∶V(去离子水)=1∶10比例混合,将混合物装入50 mL离心管中,于摇床中振荡2 h,离心,取3 mL过滤液加入铺有2层滤纸的培养皿中,滤纸润湿充分,在滤纸上放置20粒白菜种子,设置清水处理为空白对照。将培养皿在25 ℃条件下恒温培养48 h,测定种子根长并计算萌发率,每个样品设置5个重复,取平均值。Ig=(Rs×ls)/(Rc×lc)×100%,其中,Ig为发芽指数;Rs为样品发芽率;ls为样品根长;Rc为对照发芽率;lc为对照根长。

1.8 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2017进行数据处理,采用SPSS 20.0软件进行相关性分析,采用GraphPad Prism 8绘图。

2 结果与分析

2.1 候选菌株生长特征

菌株分解堆肥原料中易分解有机物释放热量是堆体热量的主要来源,低温条件下生长旺盛的微生物更易产生热量促进低温条件下堆肥起爆过程。温度适应性测定结果(图1)显示,MP-1和AS-3最适温度均为30 ℃,BC-2和AO-4最适温度均为25 ℃。菌株在15 ℃时的生长曲线见图1,菌株MP-1和AO-4生长趋势较为相似,在0～15 h时,菌株数量呈指数生长,之后继续生长达到平台期后逐渐趋于稳定;菌株BC-2和AS-3生长趋势相似,均在0～20 h内呈指数增长后逐渐趋于稳定。由图1可知,4个菌株在pH为5.0～9.0之间时都具有较高活性,最适pH为6.5～7.5;盐浓度在0.5%～1.5%之间时菌株均可较好生长,当盐浓度继续升高超过2.5%时菌株生长受到抑制。

图1 菌株生长曲线及环境条件对菌株生长的影响Fig.1 Strain growth curve and the influence of environmental conditions on strain growth

2.2 候选菌株产蛋白酶特性

蛋白酶产生能力在一定程度上反映了菌株对堆肥原料中易利用物质的分解能力。由图2可知,在培养时间内,候选菌株蛋白酶活性均呈先上升后下降,菌株MP-1、BC-2和AO-4的变化趋势相似,在24 h时产酶达到峰值,分别为82.1、43.7和80.3 U·mL-1;菌株AS-3在发酵培养12 h时酶活性达到最高(64.3 U·mL-1)。菌株MP-1、BC-2、AS-3和AO-4产蛋白酶的最适温度分别为25、35、30和25 ℃(图3)。4个株菌所产蛋白酶在不同温度下的催化活性见图4,菌株MP-1、AS-3和AO-4所产蛋白酶在10 ℃时相对酶活性可达50%以上,在所设定温度范围内,酶活性最适温度均在20～30 ℃之间;在40 ℃时酶活性下降。菌株BC-2在20 ℃以下酶活性相对较弱,20～30 ℃之间快速上升,40 ℃时达到峰值。

图2 菌株产蛋白酶的时间曲线Fig.2 Time course of the protease production of strain

图3 菌株产蛋白酶的最适温度Fig.3 Optimum temperature for the production of protease

同一组柱子上方英文小写字母不同表示同一菌株酶活性在不同温度之间差异显著(P<0.05)。图4 不同菌株产蛋白酶的最适反应温度Fig.4 Optimum temperature for production of proteases with different strains

2.3 菌剂的复配及其对堆肥浸提液的利用

根据以上测定结果,菌株MP-1、AS-3和AO-4在低温环境下均具有较好长势,适合大多数堆肥初始材料的pH环境;这3个菌株均可在低温下分泌蛋白酶,且在低温下具有较强催化活性。其中,MP-1低温繁殖能力最强。根据MARGESIN等[14]和陈秀兰等[15]对低温蛋白酶的定义,上述蛋白酶属于低温蛋白酶,而菌株BC-2产蛋白酶活性相对较弱。因此,选取菌株MP-1、AS-3和AO-4进行复配,将各菌液活菌株数调节至106cfu·mL-1;分别设置MP-1、AS-3和AO-4菌液体积比为2∶1∶1和 1∶1 ∶1进行混合培养,发现前者生长(菌液更浑浊)比后者更快,因此,后续试验将MP-1、AS-3和AO-4菌液按体积比为2∶1∶1进行复配。

菌株在不同浸提液中的生长情况,反映了菌剂利用堆肥物料中可溶性有机物进行生长繁殖的能力。如图5所示,在中药渣、鸡粪浸提液中,菌株MP-1、AS-3和AO-4都具有较好的生长能力,其中,中药渣浸提液中3者活菌数分别达到7.34×109、6.40×109和4.72×109cfu·mL-1;在鸡粪浸提液中3者活菌数分别达到9.73×109、6.81×109和7.22×109cfu·mL-1;在茶粕堆肥浸提液中3个菌株长势均较差,菌株MP-1、AS-3和AO-4数量分别为2.6×106、3.0×106和9×105cfu·mL-1。

图5 单菌及复合菌剂在不同堆肥浸提液中的生长情况Fig.5 Growth of individual strain and bacterial consortia in different compost extracts

复合菌剂IM在中药渣、鸡粪和茶粕浸提液中低温发酵24 h后活菌数分别达到1.04×1010、1.41×1010和3.6×106cfu·mL-1,在鸡粪浸提液中繁殖能力最强,茶粕浸提液中最弱,但均强于单菌,这可能是因为菌株分泌代谢产物产生协同作用。

2.4 低温起爆菌剂对冬季堆肥的影响效果评价

如图6所示,在整个堆肥过程中,环境温度维持在3～12 ℃。在堆肥初始,2个堆体温度为(8±1.5) ℃;在起爆阶段,IM处理平均升温速度为19.4 ℃·d-1(0～3 d),对照组平均升温速度为15.84 ℃·d-1(0～3 d);IM处理第2天达到高温期(57.3 ℃),在高温期维持17 d,对照组第5天达到高温期(58.2 ℃),维持13 d。

图6 堆肥过程中的温度变化Fig.6 Variations of temperature during the composting

堆肥过程中堆体含水率和pH变化见图7,2个堆体初始含水率在67%～71%之间,堆肥过程中含水率呈现逐渐下降趋势,最终,IM和对照处理含水率分别达到24.3%和30.2%,符合NY 525—2022的标准[13]。堆体初始pH均在7.8～8.1范围内,堆肥过程中均呈现先上升后下降趋势,至堆肥35 d时,IM组和对照组pH分别达到8.0和8.2,略高于初始值。在堆肥初期(0～10 d)IM的pH呈现快速上升趋势,pH值达到最高值(9.2)。

采用t检验比较IM与对照之间的差异显著性,“*”表示P<0.05,“**”表示P<0.01。图7 堆肥过程中含水率和pH变化Fig.7 Variations of water content and pH during composting

堆肥过程中IM处理和对照全氮含量都呈现先下降再上升趋势。在堆肥初始,IM和对照组w(全氮)分别为14.95和14.98 g·kg-1,至堆肥结束时分别达到19.3和20.6 g·kg-1。IM和对照组C/N都呈现下降趋势,在堆肥35 d时,IM和对照组分别达到14.2和16.5。其中,IM下降幅度更大,与初期相比下降17.2,对照组则下降15.3(图8)。

采用t检验比较IM与对照之间的差异显著性,“*”表示P<0.05,“**”表示P<0.01,“***”表示P<0.001。图8 堆肥过程中全氮(TN)含量和碳氮比(C/N)变化Fig.8 Variations of total nitrogen (TN) content and C/N during composting

堆肥过程中TP和TK的释放与稳定直接影响堆肥产品品质。如图9所示,随着堆肥时间的增加,IM和对照TP和TK含量都呈上升趋势;IM和对照组初始TP含量分别为1.65%和1.64%,至堆肥35 d时上升至3.97%和3.70%;IM和对照组TK含量分别由初始的3.51%、3.63%上升到7.78%、7.04%。

采用t检验比较IM与对照之间的差异显著性,“*”表示P<0.05,“**”表示P<0.01。图9 堆肥过程中全钾(TK)和全磷(TP)含量变化Fig.9 Variations of total potassium (TK) and total phosphorus (TP) content in each treatment during composting

IM处理和对照堆体中铵态氮含量均呈先上升后下降趋势(图10)。在堆肥初始IM处理和对照铵态氮含量在40.1～53.2 mg·L-1之间,IM处理在堆肥10 d时达到峰值(118.3 mg·L-1),对照在15 d时达到峰值(112.1 mg·L-1);堆肥35 d时,IM和对照铵态氮含量较初始值分别下降79.1%和69.7%。硝态氮含量整体呈现上升趋势,其中,堆肥初期上升速率更快,到后期逐渐变缓;堆肥初始2个堆体硝态氮含量在0.58～0.68 mg·L-1之间,堆肥结束时IM和对照硝态氮含量分别达到5.3和5.7 mg·L-1。

采用t检验比较IM与对照之间的差异显著性,“*”表示P<0.05,“**”表示P<0.01,“***”表示P<0.001。图10 堆肥过程中铵态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3--N)含量变化Fig.10 Variations of ammonium nitrogen (NH4+-N) and nitrate nitrogen (NO3--N) during composting

2.5 低温起爆菌剂对冬季工厂堆肥发芽指数的影响

腐熟度是判断堆肥质量的重要指标,为了评价低温起爆菌剂IM对冬季堆肥腐熟度的作用效果,利用种子发芽率对处理和对照堆肥腐熟度进行评价。堆肥过程中2个堆体发芽指数呈现上升趋势,堆肥35 d时IM和对照发芽指数分别为93.3%和83.1%(图11),均已达到有机肥行业标准[12];堆肥后期,处理组种子发芽指数显著高于对照(P<0.05)。这说明低温起爆菌剂IM能有效提高冬季堆肥效率和腐熟度。

采用t检验比较IM与对照之间的差异显著性,“*”表示P<0.05,“**”表示P<0.01。图11 种子萌发指数变化Fig.11 Variations of seed germination index (GI)

3 讨论

针对我国冬季堆肥起爆困难、腐熟周期长和堆肥技术推广受限这一实际问题,笔者对从极地环境中分离的4株适冷微生物生长特性进行测定并复配了低温堆肥起爆菌剂。菌株在不同浸提液中的生长情况,反映了菌株利用堆肥物料中可溶性有机物进行生长繁殖的能力,3个菌株在鸡粪、中药渣堆肥物料浸提液中长势较好,说明3株起爆菌可利用堆肥物料中的可溶性有机物来满足自身生长需要。IM复合发酵液在浸提液中的生长速度显著高于单菌,可能是因为单一微生物难以适应复杂多样的堆肥环境并充分降解物料中的养分物质。何宙阳等[16]研究表明,将芽孢杆菌、嗜热丝孢菌和嗜热芽孢杆菌B5复配成复合菌剂,与单菌降解鸡粪、猪粪以及产酶能力相比,复合菌剂能力显著增强,笔者研究结果与之一致。笔者研究中不同堆肥原料的对比结果表明,IM复合发酵液中的菌株在鸡粪中生长能力最强,可能是由于鸡粪中含有丰富的氨基酸、蛋白质和淀粉等易分解物质[17],易被微生物吸收利用。

堆肥中试试验中,IM处理升温速度显著快于对照,提前3 d进入高温期,说明适低温微生物可以有效增强有机物料的降解,促进堆体起爆升温。此外,接种菌剂可以高效分解废弃物中植物毒性物质,加快堆肥的无害化进程,堆肥结束时IM和对照GI值分别达到93.3%和83.1%。IM处理和对照TP和TK相对含量都呈现上升趋势,这是因为堆肥过程中微生物分解有机物的活动相对提高了P和K含量[18]。IM处理和对照铵态氮含量都呈先上升后下降趋势,硝态氮含量均呈现上升趋势;其原因可能是前期堆肥物料中氨基酸、蛋白质等小分子物质易被分解释放大量铵态氮,从而使得堆体中铵态氮含量上升快速;在堆肥降温腐熟阶段,由于微生物的硝化作用,使得铵态氮向硝态氮转换,使铵态氮含量逐渐减少[19],此与黄炎[20]研究结果相似。IM处理和对照TN含量都呈先下降再上升趋势,接种IM菌剂的处理组C/N下降更快,可能是由于堆肥初期接种IM菌剂快速消耗物料中的碳水化合物使得C/N上升[21],到堆肥后期微生物开始利用木质素、纤维素等转化为腐殖质,微生物活动减弱,C/N逐渐趋于稳定,此与竹江良等[22]研究结果一致。