富硒大米的饮料制作工艺及其抗氧化作用研究

2024-01-29崔承弼金敏淇刘勃辰刘禹彤魏金峰

延边大学农学学报 2023年4期

刘爽, 崔承弼,*, 金敏淇, 刘勃辰, 刘禹彤, 魏金峰

(1.延边大学融合学院;2. 延边大学农学院：吉林延吉 133002; 3.延边平岗绿洲现代农业科技有限公司,吉林和龙 133500)

硒是人体内的一种必需微量元素,广泛存在于人体的各个器官当中。硒元素对人体的生理和保健功能都大有益处,例如硒可以增强机体免疫力、解毒、抗癌,以及对心、肝等脏器具有保护作用;除此之外,硒元素还可以预防近视,具有提升生殖功能、美容养颜等药理作用,因此人们赋予硒元素以“生命之火”、“抗癌之王”的美誉[1]。

抗氧化是近年来国内外学者对功能性食品的一个重要研究课题。对于人体的衰老,有研究认为是体内过多的氧自由基诱发脂质过氧化,使细胞膜结构受到损伤,从而引起细胞破坏老化和功能障碍[2]。自由基是需氧生物体呼吸作用中不可避免产生的中间代谢产物,极其不稳定,会与生命大分子物质反应,造成有机体的损伤,从而加速细胞老化和致癌等[3-4]。许多疾病的发生与活性氧引发的氧化反应有关,如肿瘤、衰老、心脑血管疾病等[5]。为降低自由基对人体的危害,将具有天然抗氧化剂的食品作为日常膳食补充剂是一种常用做法[6],且硒本身具有一定的抗氧化作用,因此含硒的物质可以作为重要的抗氧化剂。同时,大米是我国的主要粮食作物,是大多数地区居民膳食结构中的主要组成部分[7],是人体补充各种营养元素的重要途径,其硒含量和形态与人体硒营养状况关系非常密切[8]。大米对硒具有一定的生物富集作用,可将吸收的无机硒转化为有机硒[9]。因此,富硒大米是补充人体硒元素,实现科学补硒最有效的方式。

随着当今社会消费的不断升级,人们为了追求更美好的生活品质,在饮食方面更加注重吃得健康、吃得营养[10],硒元素也随之慢慢地进入到大众视野当中。由于前几年的疫情冲击,大家逐渐意识到免疫力对于战胜疾病的重要性,营养补充也成为了人们关注的热点,世界各国兴起对保健饮料的开发与应用研究,保健饮料也越来越受到消费者的青睐[11],消费者对饮料的需求不再只是满足消暑解渴的目的,而是同时考虑营养保健功效[12]。再加上富硒产品的兴起,所以富硒饮料市场的前景十分广阔[13]。

目前,我国对于富硒大米的相关研究主要侧重于富硒大米中硒含量的提取与检测[14-15],但对于富硒大米的抗氧化活性以及产品的研究开发还有待深入。基于此,该研究通过测定富硒大米对DPPH·、ABTS+、·OH清除能力以及总抗氧化能力等理化指标,测定了富硒大米的抗氧化活性;同时通过单因素和正交试验确定富硒大米饮料的最佳酶解条件和饮料制作最佳配方,最后通过感官评分值制成风味独特的富硒大米饮料,为富硒大米功能性饮料的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

富硒大米(延边乾丰实业有限公司提供);α-淀粉酶(江苏锐阳生物科技有限公司);抗坏血酸(Vc)(国药集团化学试剂有限公司);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS+)、羟自由基(·OH)(上海源叶生物科技有限公司);2,4,6-三(2-吡啶)-1,3,5-三嗪(TPTZ)(天津市科密欧化学试剂有限公司);柠檬酸(潍坊英轩实业有限公司);FeSO4溶液(天津市永晟精细化工有限公司);H2O2溶液(中国惠世生化试剂有限公司上海);冰醋酸(天津市华东试剂厂);结晶乙酸钠(天津市永大化学试剂有限公司)。

DF-35落地式连续投料粉碎机(温岭市林大机械有限公司);HWS-24电热恒温水浴锅(上海一恒仪器有限公司);TG16A-WS离心机(上海卢湘仪器有限公司);BXM-30R立式压力蒸汽灭菌机(上海卢湘仪器有限公司);PHS-3C精密PH计(温州市一州机械有限公司);ME204E分析天平(上海人和科学仪器有限公司);SP-Max3500FL多功能荧光酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司)。所有试剂均为分析级试剂,并按照说明储存。

1.2 富硒大米提取物的制备

取适量富硒大米,将未成熟米、异色米粒等挑选干净,用蒸馏水洗涤,直至表面的糠粉和灰尘洗净为止,沥干。然后将富硒大米放置烘箱中,调节温度至50 ℃,干燥3 h,使富硒大米表面完全干燥后取出。将富硒大米放入粉碎机中粉碎,过60目筛,放置于洁净干燥的密封袋中,备用。

1.3 富硒大米α-淀粉酶酶解单因素试验设计

1.3.1 加酶量对酶解情况的影响

分别精密称取6 g富硒大米粉末,按照α-淀粉酶含量为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%,将其置于80 ℃,pH值6.5的环境下,加热50 min,并对结果进行感官评价,从而确定最佳加酶量。

1.3.2 加热温度对酶解情况的影响

分别精密称取6 g富硒大米粉末,按照加酶量为0.5%,加热温度65、70、75、80、85 ℃,pH值为6.5环境下,加热50 min,并对结果进行感官评价,从而确定最佳加热温度。

1.3.3 pH值对酶解情况的影响

分别精密称取6 g富硒大米粉末,按照加酶量为0.5%,pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,将其置于80 ℃,加热50 min,并对结果进行感官评价,从而确定最佳pH值。

1.3.4 加热时间对酶解情况的影响

分别精密称取6 g富硒大米粉末,按照加酶量为0.5%,在80 ℃、pH值为6.5的环境下,分别加热40、50、60、70、80 min,并对结果进行感官评价,从而确定最佳加热时间。

1.4 富硒大米α-淀粉酶酶解正交试验设计

在单因素试验的基础上,对富硒大米的提取条件进行优化。选择加酶量、酶解温度、酶解时间、pH值4个因素做正交试验,从而优化α-淀粉酶酶解富硒大米工艺条件,最终结果以感官评价的评分来确定酶解效果[16]。依据单因素试验结果,以富硒大米汁的加酶量、酶解温度、酶解时间、pH值进行4因素3水平正交试验设计[17],试验因素与水平见表1。

表1 富硒大米酶解正交试验因素与水平

1.5 富硒大米饮料配方单因素试验设计

1.5.1 不同大米汁含量对富硒大米饮料口感的影响

分别精密称取50、60、70、80、90 mL大米汁,分别向其中加入6%蔗糖和0.2%柠檬酸,搅拌均匀,配制成富硒大米饮料,并对结果进行感官评价,从而确定最佳大米汁含量。

1.5.2 不同蔗糖浓度对富硒大米饮料口感的影响

取多组添加0.2%柠檬酸的70 mL的大米汁,分别向其中加入2%、4%、6%、8%、10%的蔗糖,搅拌均匀,配制成富硒大米饮料,并对结果进行感官评价,从而确定最佳蔗糖浓度。

1.5.3 不同柠檬酸浓度对富硒大米饮料口感的影响

取多组添加6%蔗糖的70 mL大米汁,分别向其中加入0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的柠檬酸,搅拌均匀,配制成富硒大米饮料,并对结果进行感官评价,从而确定最佳柠檬酸浓度。

1.6 富硒大米饮料配方正交试验设计

在单因素试验的基础上,对富硒大米饮料的配方进行优化。选择大米汁含量、蔗糖浓度、柠檬酸浓度3个因素做正交试验,从而优化富硒大米饮料配方工艺条件,其最终结果以感官评价的评分来确定饮料制作最佳配方。依据单因素试验结果,以大米汁含量、蔗糖浓度、柠檬酸浓度进行3因素3水平正交试验设计,试验因素与水平见表2。

表2 富硒大米饮料配方正交试验因素与水平

1.7 杀菌方法

为了研究不同灭菌条件对饮料稳定性的影响,脱气时将饮料温度控制在70～75 ℃。该试验的灭菌方式采用高温灭菌法。杀菌条件对饮料稳定性的影响见表3。

表3 杀菌方式试验设计

由于高温灭菌会对饮料稳定性有一定影响,在试验过程中对富硒大米饮料采取不同的灭菌温度和灭菌时间,分别在110 ℃条件下灭菌25、30 min,在115 ℃条件下灭菌20、25 min,在121 ℃条件下灭菌15、20 min,并在室温下放置3 d,观察其稳定性。

1.8 感官评价

试验由20位身体健康、无感官缺陷、来自不同专业的师生组成感官评定小组,对不同处理阶段的富硒大米饮料分别从色泽、质地、香气、口感4个方面进行感官评价,评定分数采用100分值。评分标准具体见表4。

表4 感官评价标准

感官测评小组根据相应评定指标对待测样品进行感官评测,并以色泽是否呈淡黄色且透明,以及色泽分布是否均匀;香气是否醇厚无异味;质地是否细腻且无沉淀,以及适口度的不同给予感官上的相应分数。每次评定后,取消最高分和最低分取平均值作为试验最终记录值,以感官评定的平均分为最后得分,确定最优产品。

1.9 富硒大米的抗氧化活性测定

1.9.1 DPPH·自由基清除能力测定

参考梁英琪等的方法,并进行修改[18-19]。取不同浓度的样液20 μL加入配好的DPPH溶液180 μL,酶标仪于560 nm处测定吸光值Ai;等体积乙醇溶液代替DPPH溶液作空白对照组Aj;蒸馏水代替样品作对照组A0。

1.9.2 ABTS+自由基清除能力测定

参考王佰灵等的方法,并进行修改[20-21]。取不同浓度样液30 μL,加入配好的ABTS溶液270 μL,酶标仪于405 nm处测定吸光值Ai;等体积蒸馏水代替ABTS溶液作空白对照Aj;蒸馏水代替样品作为对照A0。

1.9.3 ·OH自由基清除能力测定

参考王晴等的方法,并进行修改[22-23]。取不同浓度的样液2 mL,加入2 mL FeSO4溶液和2 mL H2O2溶液,静置6 min后加入2 mL水杨酸溶液,记为As;蒸馏水代替As组的水杨酸溶液,记为Ar;蒸馏水代替样品作空白对照组,记为A0。

1.9.4 总抗氧化能力测定

60 μL FeSO4溶液(0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mmol/L)、6 mL FRAP工作液、25 mL TPTZ盐酸溶液(10 mmol/L)和 50 mL FeCl3溶液(20 mmol/L)。在37 ℃黑暗中孵育30 min,测量593 nm处的光吸收值,绘制回归曲线：y=0.063x+0.033 1(R2=0.992 7)。

富硒大米溶液(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL)代替FeSO4标准溶液。其余按照上述方法操作,593 nm处测定吸光值A。根据标准曲线计算样品溶液的FRAP值[24]。

1.10 数据处理

使用GraphPad Prism 8.0和Excel软件进行统计和绘制图表,通过SPSS 26.0软件进行显著性差异分析[25]。P<0.05为显著性差异,P>0.05表示无显著性差异。

2 结果与分析

2.1 富硒大米饮料的工艺研究

2.1.1 富硒大米α-淀粉酶酶解试验

1) 富硒大米α-淀粉酶酶解单因素试验结果

如图1-A所示,当α-淀粉酶添加量为0.1%～0.9%时,感官评价分值呈现先递增后递减的趋势;当富硒大米α-淀粉酶添加量为0.5%时,感官评价分值达到峰值,此时继续添加α-淀粉酶,随着加酶量的提高,感官评价分值随之降低。因此,选择富硒大米α-淀粉酶添加量为0.3%～0.7%,富硒大米饮料的酶解情况最佳。

注：不同字母表明不同组下样品差异显著(P<0.05),下同。

如图1-B所示,当pH值为5.5～7.5时,感官评价分值呈现先递增后递减的趋势;当富硒大米pH值为6.5时,感官评价分值达到峰值,将其置于pH值更高的环境中,随着pH值的提高,感官评价分值随之降低。因此,富硒大米酶解时选择pH值为6.0～7.0,富硒大米饮料的酶解情况最佳。

如图1-C所示,当酶解温度为65～85 ℃时,感官评价分值呈现先递增后递减的趋势。当富硒大米酶解温度为75 ℃时,感官评价分值达到峰值,此时提高酶解温度,随着温度的升高,感官评价分值随之降低,尤其在80～85 ℃降低更为明显。因此,选择富硒大米酶解温度为70～80 ℃,富硒大米饮料的酶解情况最佳。

如图1-D所示,当酶解时间为40～50 min时,感官评价分值迅速上升,当酶解温度在50 min时,感官评价分值达到峰值,此时延长酶解时间,酶解时间为50～80 min时,随着酶解时间的增加,感官评价分值随之降低。因此,选择酶解时间为40～60 min,富硒大米饮料的酶解情况最佳。

2) 富硒大米正交试验结果

在单因素试验结果基础上,选择加酶量(0.3%、0.5%、0.7%)、pH值(6.0、6.5、7.0)、酶解温度(70、75、80 ℃)、酶解时间(50、60、70 min)4个因素,进行4因素3水平正交试验。正交试验结果与分析见表5。

表5 富硒大米α-淀粉酶酶解正交试验结果

由试验可知根据直观分析法中极差R的大小,对因素进行主次排列,其次序可以排列为：A>B>C>D,即加酶量为最主要的因素,其次为pH值,其最佳组合为A2B2C3D1,因此,最佳酶解条件是在酶浓度0.5%,pH值6.5的环境中,80 ℃加热50 min,此时酶解效果最佳,最终获得80分,为最高的感官评价值。

2.1.2 富硒大米饮料配方试验结果

1) 富硒大米饮料配方单因素试验结果

如图2-A所示,大米汁添加量为50～90 mL时,感官评价分值呈现先递增后递减的趋势。当富硒大米汁添加量为70 mL时,感官评价分值达到峰值,此时继续添加大米汁,随着大米汁含量的提高,感官评价分值随之降低。因此,选择富硒大米汁添加量为50～70 mL,富硒大米饮料配方情况最佳。

图2 饮料配方对感官评价的影响

如图2-B所示,蔗糖添加量为2%～10%时,感官评价分值呈现先递增后递减的趋势。当蔗糖添加量为4%时,感官评价分值达到峰值,此时继续添加蔗糖,随着蔗糖含量的提高,感官评价分值随之降低。因此,选择蔗糖添加量为4%～8%,富硒大米饮料配方情况最佳。

如图2-C所示,柠檬酸添加量为0.2%～0.6%时,感官评价分值呈现先递增后递减的趋势。当柠檬酸添加量为0.3%时,感官评价分值达到峰值,此时继续添加柠檬酸,随着柠檬酸含量的提高,感官评价分值呈梯度下降趋势。因此,选择蔗糖添加量为0.2%～0.4%,富硒大米饮料配方情况最佳。

2) 富硒大米饮料配方正交试验结果

在单因素试验结果基础上,选择大米汁含量(50、60、70 mL)、蔗糖添加量(4.0%、6.0%、8.0%)、柠檬酸添加量(0.2%、0.3%、0.4%)3个因素,进行3因素3水平正交试验。正交试验结果与分析见表6。

表6 富硒大米饮料配方正交试验结果

由试验可知,根据直观分析法中极差R的大小,对因素进行主次排列,其次序可以排列为：C>B>A,即柠檬酸含量为最主要的因素,其次为蔗糖含量,其最佳组合为A3B1C2,因此,蔗糖添加量为4%,大米汁70 mL,柠檬酸添加量为0.3%时,最受大家喜爱,饮料配方最佳,最终获得78.5分,为最高的感官评价值。

2.1.3 杀菌条件确定

通过试验得出不同灭菌温度和灭菌时间下饮料的稳定性,结果见表7。

表7 不同灭菌条件对饮料稳定性的影响结果

在121 ℃灭菌20 min,饮料不分层,产品呈淡乳黄色,效果更好,故得出结论,在121 ℃,灭菌20 min为最佳灭菌条件。将灌装好的饮料置于121 ℃下,灭菌20 min,迅速冷却至室温,经检查无染菌、分层、胀盖现象,即得到富硒大米饮料成品。

2.1.4 感官指标

富硒大米饮料为乳白色,色泽均一;在保留大米本身香气的基础上,兼具有酸味和甜味,口感清柔;质地均匀,无明显沉淀。

2.2 富硒大米抗氧化作用研究

2.2.1 DPPH·自由基清除能力结果

DPPH·是一种相对稳定的自由基,它能接收到电子或氢原子,从而形成稳定的抗磁分子[26]。抗氧化能力强的物质清除能力越强,其颜色褪去或消失,因此,DPPH被广泛用于测量自由基是否有清除活性[27]。从图3可以看出,在0.4～2.0 mg/mL浓度范围内,富硒大米提取液对DPPH·的清除能力与浓度呈现一定程度的正相关。同时,随着乙醇溶液的添加,富硒大米提取液浓度达到2.0 mg/mL时显示出明显的清除能力。与富硒大米+乙醇溶液相比,Vc+乙醇溶液对DPPH·的清除能力明显更强,在浓度为2.0 mg/mL时,富硒大米和Vc对乙醇的DPPH清除率分别高达(85.28±0.32)%、(98.96±0.41)%,经分析可知,富硒大米提取液和Vc溶液对DPPH·在试验范围内均有一定的清除效果,乙醇组与蒸馏水组对比,乙醇组更能增强富硒大米提取液和Vc溶液的清除能力,由此可见,富硒大米具有一定的DPPH·清除能力。

图3 Vc和富硒大米的DPPH自由基清除能力

2.2.2 ABTS+自由基清除能力结果

ABTS可用于亲水性和亲脂性物质的抗氧化能力测定,在乙醇溶液中呈现蓝绿色,并且在734 nm或405 nm处具有特征吸收峰,当有抗氧化物存在时,ABTS+的产生被抑制使反应体系褪色,405 nm处吸光度下降,在一定范围内其吸光值与自由基被清除的程度成正比,通过吸光值下降的程度,就可以反映样品的ABTS+的清除能力。所以ABTS+测定可作为反映样品总抗氧化活性的指标[28]。从图4可以看出,在浓度范围内,富硒大米的清除率呈增长趋势,说明富硒大米对ABTS+具有很强的清除能力。当富硒大米提取液在0.30 mg/mL浓度时,随着乙醇溶液的添加,ABTS+的清除能力明显提高。而对于Vc溶液,当浓度为0.1～0.3 mg/mL时,随着蒸馏水或乙醇溶液的添加,Vc溶液对ABTS+的清除率差异不显著(P>0.05),整体呈现平稳趋势.而富硒大米提取液和Vc溶液在相同浓度下均差异显著(P<0.05)。在浓度0.3 mg/mL时,对于蒸馏水组,富硒大米提取液对ABTS+的清除率为(48.42±0.28)%,Vc溶液对ABTS+的清除率高达(99.14±0.17)%,对于乙醇溶液组,富硒大米提取液对ABTS+的清除率为(48.41±0.27)%,Vc溶液对ABTS+的清除率高达(99.50±0.62)%。经分析可知,富硒大米提取液对ABTS+清除能力在试验范围内具有一定的清除效果,但弱于Vc溶液。

图4 Vc和富硒大米的ABTS自由基清除能力

2.2.3 ·OH自由基清除能力结果

由于H2O2和Fe2+的协同作用,产生了对生物体毒性最大、危害最强的自由基,即·OH,这种自由基会造成组织损伤和细胞的死亡[29]。由图5可知,当浓度为0.4～2.0 mg/mL时,随着浓度的增加,富硒大米蒸馏水组的清除率呈梯度上升,但都弱于Vc。当浓度为2.0 mg/mL时,富硒大米和Vc溶液清除率可达到(75.30±1.57)%、(99.56±0.29)%,有较好的·OH清除活性。而富硒大米乙醇组虽然没有像蒸馏水组形成较好的线性关系,但当浓度达到2.0 mg/mL时,富硒大米提取液乙醇组对·OH的清除能力较明显。Vc溶液蒸馏水组在浓度为0.4～2.0 mg/mL时,·OH的清除能力始终很强,但此时随着乙醇溶液的添加,Vc溶液对·OH的清除能力略显下降。富硒大米提取液和Vc溶液在每组浓度下均差异显著(P<0.05)。在浓度2.0 mg/mL时,对于蒸馏水组,富硒大米提取液对·OH的清除率为(51.27±0.25)%,Vc溶液对·OH的清除率高达(99.47±0.17)%,对于乙醇溶液组,富硒大米提取液对·OH的清除率为(69.85±0.63)%,Vc溶液·OH的清除率高达(89.74±0.54)%。经分析可知,富硒大米提取液和Vc溶液对·OH在一定范围内均有一定的清除效果。

图5 Vc和富硒大米的羟自由基清除能力

2.2.4 总抗氧化能力测定结果

酸性条件下,抗氧化剂与Fe3+-TPTZ反应,使其还原为蓝紫色的Fe2+-TPTZ,根据溶液颜色的变化,可反映出待测样品的还原能力,最后由吸光值测定FRAP值,两者呈正相关[30]。由图6可知,在浓度为0.4～2.0 mg/mL时,富硒大米提取液与Vc溶液的浓度均与FRAP值呈现良好的线性关系,同时,乙醇溶液的添加,明显提高了富硒大米提取液的总抗氧化能力,其中,当浓度为1.2～2.0 mg/mL时,乙醇溶液添加后,富硒大米提取液的FRAP值增长的略有缓慢,但整体仍呈现上升趋势。

图6 Vc和富硒大米的FRAP值

富硒大米提取液和Vc溶液在每组浓度下均差异显著(P<0.05)。在2.0 mg/mL浓度下,对于蒸馏水组,富硒大米提取液的FRAP值为(0.23±0.02) mmol/L,Vc溶液的FRAP值为(0.29±0.04) mmol/L,对于乙醇溶液组,富硒大米提取液的FRAP值为(0.25±0.05) mmol/L,Vc溶液的FRAP值为(0.35±0.03) mmol/L。经分析可知,在浓度为0.4～2.0 mg/mL时,富硒大米提取液和Vc溶液均有一定的抗氧化能力,尤其乙醇溶液添加后,对富硒大米提取液和Vc溶液的抗氧化能力均有一定程度的提高,对Vc溶液效果更明显。