基于网络药理学和分子对接技术探讨当归四逆汤治疗系统性硬化症的作用机制

李世哲 ，王蕾 ，宋光富

1.吉林工程技术师范学院 化学与工业生物工程交叉学科研究院，吉林 长春 130052

2.新型分子功能材料吉林省校企联合技术创新实验室，吉林 长春 130052

3.吉林工程技术师范学院 生物与食品工程学院，吉林 长春 130052

系统性硬化症又称硬皮病，是一种罕见且病因不明的自身免疫性疾病。其主要特征为广泛血管病变和多器官组织的进行性纤维化，可累及皮肤、心脏、胃肠道和肾脏等多器官组织，严重影响患者生活质量甚至危及生命[1-3]。本病发病机制尚不明确，且缺少公认有效治疗方法[4]。现有研究表明系统性硬化症发病过程与免疫异常、血管损伤及细胞外基质合成过多密切相关[5-6]。西医治疗多采用钙离子拮抗剂、糖皮质激素、结缔组织抑制剂和免疫抑制剂等控制病情发展，但疗效不佳且不良反应较大[7]。在中医领域中，系统性硬化症属于“痹证”范畴，《素问·痹论》记载有“风湿寒三气杂至，合而为痹也，”并认为该病是由阳虚凝寒、痰淤互结、血脉不通所致[8]。

当归四逆汤出自《伤寒论》：“手足厥寒，脉细欲绝者，当归四逆汤主之”[9]。该方剂由当归、桂枝、芍药、细辛、通草、大枣、炙甘草组成，具有温经散寒，养血通脉之功效[9-10]。方中当归为君药补血，芍药为臣滋养营气，佐以桂枝、细辛温散寒邪，大枣、甘草为使甘温健脾补中，通草通行脉道[10]。现代临床研究表明，当归四逆汤对系统性硬化症具有确实疗效，且不良反应较少，与西药联用能提高疗效，并减轻西药的不良反应[11-12]。现代药理学研究表明，当归四逆汤具有抗凝及抗血栓形成、扩张血管末梢、镇痛、抗炎及解痉等作用[10,13-15]；能够明显改善系统性硬化症模型小鼠的皮肤硬化情况，并能降低组织中结缔组织生长因子（CTGF）和转化生长因子-β（TGF-β）的含量[16]；但当归四逆汤对系统性硬化症的治疗机制尚待研究。

网络药理学是一门基于数据库挖掘和高通量组学分析的交叉学科，并被广泛用于药物活性物质的整体作用机制研究[17]。据此，本研究采用网络药理学和分子对接技术系统分析当归四逆汤对系统性硬化症的治疗过程，为将来进一步的实验研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 当归四逆汤活性成分的获取与靶点的预测

分别以“当归”“桂枝”“白芍”“细辛”“通草”“甘草”“大枣”为关键词，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 为标准，在中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中检索当归四逆汤的活性成分。

1.2 潜在作用靶点的获取

利用PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获得各活性成分SMILES 式。将各SMILES 式输入SwissTargetPrediction 数据库预测各活性成分的药物靶点。在GeneCards 数据库（https://www.genecards.org ）中 以“ systemic scleroderma”为关键词检索获得相关疾病靶点。利用UniProt 数据库将所得药物靶点和疾病靶点转化为标准化基因名称，再利用OmicShare 平台（https://www.omicshare.com/）的韦恩图工具绘制韦恩图，并获得药物靶点和疾病靶点的交集，所得交集即为当归四逆汤治疗系统性硬化症的潜在作用靶点。

1.3 蛋白质相互作用（PPI）网络和“化合物-靶点”网络

将所得潜在作用靶点导入 String 数据库（https://www.omicshare.com），并将物种设定为“Homo Sapiens”，置信度设置为0.4，构建PPI 网络并获得与治疗相关性更强的PPI 靶点，同时以Cytoscape 3.7.2 软件将PPI 网络可视化，再利用Cytoscape 软件中的network analyzer 插件进行网络拓扑分析获得各靶点的degree 值，并以degree 值为标准筛选PPI 网络中的核心靶点（degree 值＞2 倍平均值）。将PPI 靶点及相关活性物质信息导入Cytoscape 软件中构建“化合物-靶点”网络，用于分析当归四逆汤中活性成分与潜在作用靶点之间的关系，并通过网络拓扑分析获得各活性成分靶点在“化合物-靶点”网络中的degree 值。

1.4 富集分析和关键靶点筛选

将PPI 靶点导入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov）中进行基因本体（GO）功能和京都基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，选择物种“Homo Sapiens”，设定阈值错误发现率（FDR）＜0.01。其中GO 功能富集分析包括细胞组分（CC）、生物过程（BP）、分子功能（MF）3 个部分。以FDR值排序后选择排名前20 位的条目用于下一步分析，用OmicShare 平台中高级气泡图工具实现可视化。

根据现有临床研究和药理学研究对KEGG 通路分析所得结果进行筛选，剔除不相关通路。将筛选所得通路和其相关靶点信息输入Cytoscape软件，建立“通路-靶点”网络进行拓扑网络分析获得各靶点的degree 值，并以degree 值为标准筛选网络核心靶点（degree 值＞2 倍平均值）。筛选PPI 网络核心靶点和“通路-靶点”网络核心靶点的交集，作为当归四逆汤治疗系统性硬化症的关键靶点。

1.5 分子对接

基于当归四逆汤对系统性硬化症治疗关键靶点筛选结果，以相关活性物质为配体，关键靶点作为受体进行分子对接，验证分析结果并预测治疗中的潜在药效成分。从RSDB PDB 数据库（https://www1.rcsb.org）获取关键靶点结构，通过TCMSP数据库获得相关活性物质的mol2 格式分子式，导入CB-Dock 网站（http://clab.labshare.cn/cb-dock/php/index.php）进行分子对接并将结果可视化，以Vina Score 作为结合能力评价指标筛选潜在药效成分（低于平均Vina Score）。

2 结果

2.1 活性物质的筛选和靶点预测

分别检索当归、桂枝、白芍、细辛、通草、甘草、大枣中有效成分，筛选得到2、7、13、8、4、92、29 个活性成分，去重后共计得到141 个活性成分，见表1。

表1 当归四逆汤活性成分Table 1 Active ingredient of Danggui Sini Decoction

2.2 疾病靶点的获取

将活性成分 SMILES 式导入 SwissTarget Prediction 数据库预测靶点，共得到1 047 个靶点。以“systemic scleroderma”为关键词在GeneCards 数据库检索，经过去重后共获得1 568 个与系统性硬化症相关的疾病靶点。经筛选后共得到当归四逆汤治疗系统性硬化症的潜在作用靶点266 个，图1。

图1 当归四逆汤与系统性硬化症靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of targets of Danggui Sini Decoction and systemic sclerosis

2.3 PPI 网络和“化合物-靶点”网络

将266 个交集靶点导入String 数据库中生成PPI 网络，并以Cytoscape 软件实现可视化，见图2A。PPI 网络中共包含261 个节点和4 992 条边，节点平均degree 值38.25。图中节点代表靶点，边代表靶点之间相互关联。经拓扑网络分析筛选出29个靶点作为PPI 网络的核心靶点，见图2B，如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）、蛋白激酶B1（Akt1）、白蛋白（ALB）等。基于所得PPI 靶点及相关活性成分信息，以Cytoscape 软件构建“化合物-靶点”网络，见图3，其中包含125 个活性成分节点和261 个靶点节点。“化合物-靶点”网络表示了当归四逆汤治疗系统性硬化症的多组分作用于多靶点的治疗特点，活性成分的degree 值越高，说明其能够作用于更多的靶点并可能在治疗中发挥更多的作用。

图2 当归四逆汤治疗系统性硬化症靶点PPI 网络图（A）和PPI 网络的核心靶点（B）Fig.2 PPI network of therapeutic targets of Danggui Sini Decoction for systemic sclerosis (A) and core targets of PPI network (B)

图3 “化合物-靶点”网络Fig.3 “Compound-target” network

2.4 富集分析和关键靶点筛选

将所得PPI 靶点导入DAVID 数据库进行GO功能富集分析，在FDR＜0.01 条件下筛选得到520条GO 条目，其中BP 条目399 条，CC 条目48 条，MF 条目73 条，以FDR 值排序后取各项前20 位的条目绘制气泡图，见图4。其中BP 分析结果显示，作用靶点主要富集于细胞增殖、细胞迁移、炎症响应、血管病变、蛋白质磷酸化、细胞外基质、信号传导、蛋白质水解等。CC 分析结果说明，作用靶点广泛富集于细胞核、细胞质、细胞膜等部位。MF 分析结果表明，作用靶点可影响蛋白激酶活性和蛋白结合。

图4 GO 功能富集分析和KEGG 通路分析Fig.4 GO enrichment and KEGG pathway enrichment analysis

将所得PPI 靶点导入DAVID 数据库进行KEGG 通路富集分析，在FDR＜0.01 条件下共筛选得到148 条信号通路，按照FDR 值排序后取前20位的信号通路绘制气泡图，见图4。剔除与系统性硬化症不相关通路后，筛选得到促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 信号通路、Rap1 信号通路、黏着斑（focal adhesion）、脂质和动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、流体剪切应力和动脉粥样硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）等关键通路，见表2，这些通路主要涉及免疫、血管损伤和细胞外基质等调节。

表2 关键通路信息Table 2 Information of key pathways

基于信号通路筛选结果，将所得通路及相关靶点信息输入Cytoscape 软件建立“通路-靶点”网络，见图5。如图所示，“通路-靶点”网络包含6个信号通路节点和98 个靶点节点。经网络拓扑分析获得各靶点节点的degree 值，并以degree 值为标准筛选出“通路-靶点”网络的核心靶点，比对PPI 网络核心靶点和“通路-靶点”网络核心靶点后得到交集，见图6，交集靶点即为当归四逆汤治疗系统性硬化症的关键靶点。

图5 “通路-靶点”网络图Fig.5 Network of “pathways-targets”

图6 “通路-靶点”网络的核心靶点Fig.6 Core targets of “pathways-targets” network

2.5 分子对接

基于关键治疗靶点筛选结果将Akt1、血管内皮生长因子受体2（KDR）、V-Ha-Ras 肉瘤病毒癌基因同源物（HRAS）、MAPK1、MAPK3、血管内皮生长因子A（VEGFA）作为大分子受体，将相关活性成分作为配体，采用CB-Dock 进行分子对接。CB-Dock 使用基于空腔检测法和配体结合姿态的AutoDock Vina 来预测蛋白的结合位点，Vina score是对受体和配体以相应参数对接而得到复合物的评分，评分越低说明二者结合越稳定[18-19]。分子对接结果显示，与Akt1、KDR、HRAS、MAPK1、MAPK3、VEGFA 结合能力较强的活性成分（低于平均Vina score）分别有6、18、2、6、5、4 个，这些结合能力较强的活性成分也可能是治疗中发挥作用的潜在药效成分。在这些药效成分中，与Akt1、KDR、HRAS、VEGFA 结合能力最强的药效成分分别是shinpterocarpin、水鬼蕉宾碱、芍药苷、酸枣仁皂苷A，而原卟啉与MAPK1 和MAPK3 结合能力最强，见图7。

图7 分子对接结果可视化分析图Fig.7 Visual analysis diagram of molecular docking results

3 讨论

本研究结果表明，当归四逆汤对系统性硬化症的治疗具有多组分通过多靶点调节多通路的特点。经过一系列网络分析后得出当归四逆汤对系统性硬化症治疗的关键靶点为Akt1、KDR、HRAS、MAPK1、MAPK3、VEGFA。其中Akt1 是一种调控免疫和炎症的激酶，Akt1 蛋白水平可以影响系统性硬化症模型小鼠皮肤硬化、间质性纤维化和炎症情况[20-21]。VEGFA 是影响血管内皮细胞增殖、迁移和存活的主要生长因子之一，KDR 为其主要受体，VEGF/KDR 信号能够促进内皮细胞的增殖、存活、黏附和迁移等，并与各类涉及病理性血管生成的疾病相关[22-23]。同时，KDR 和VEGFA 的表达上调和对VEGF/KDR 信号的激活也被认为在系统性硬化症的血管损伤中发挥重要作用[23]。MAPK 能够连接细胞外刺激和细胞内调节过程，协调环境变化对细胞反应和细胞信号间的影响[24]。有研究表明，MAPK3/MAPK1 信号的抑制能够用于各类炎症性疾病的治疗[25]。此外，在对系统性硬化症模型动物组织中mRNAs 的N6-甲基腺苷甲基化研究中发现，HRAS 在甲基化和表达中发生明显变化，说明其在表观遗传机制中发挥重要作用，预示着其可能作为系统性硬化症疾病的治疗靶点[26]。

根据分子对接结果，共筛选出芍药苷、shinpterocarpin、水鬼蕉宾碱、酸枣仁皂苷A_qt、原卟啉等57 个与关键靶点结合能力较强的活性成分。因其与靶点良好的结合能力，这些活性成分也可能是当归四逆汤治疗系统性硬化症的潜在药效成分。这些成分可通过对相关靶点的作用从而调节相关通路，进而发挥药效功能。芍药苷在“化合物-靶点”网络中具有高于平均水平的degree 值，说明其能与更多的药物靶点对应并发挥更广泛的药效作用。分子对接结果显示，芍药苷是与HRAS 结合能力最强的药效组分；同时也与KDR 和VEGFA 具有较强的结合能力，说明芍药苷能通过调节多靶点并发挥广泛的药效功能。有研究表明，芍药苷能够抑制VEGF 及相关受体表达进而抑制血管增生，从而实现对慢性炎症的治疗[27]。此外，芍药苷还能通控制血管内皮细胞产生一氧化氮（NO）实现对内皮细胞的保护作用[28]。“通路-靶点”网络指出，芍药苷能同时通过HRAS、KDR、VEGFA 参与MAPK 信号通路、PI3K/Akt 信号通路、Rap1 信号通路和黏着斑的调节，即芍药苷可能通过HRAS、KDR、VEGFA调节上述通路实现对系统性硬化症治疗药效作用。

KEGG 通路富集分析结果显示，MAPK 信号通路、PI3K/Akt 信号通路、Rap1 信号通路、黏着斑、脂质和动脉粥样硬化和流体剪切应力和动脉粥样硬化等为当归四逆汤治疗系统性硬化症的关键通路，这些通路主要涉及免疫、血管损伤和细胞外基质等调节。有研究表明，KDR 可以激活PI3K/Akt 信号通路并调节内皮细胞的增殖过程[29]；VEGFA 通过KDR 介导激活MAPK 信号通路从而促进内皮细胞的迁移[30]。内皮细胞间连接处的KDR 蛋白受应力刺激激活后可激活下游的Akt 和MAP 激酶并产生NO，进而影响系统性硬化症血管损伤病变[31-32]。Rap1 在VEGF 诱导的内皮细胞迁移过程中发挥重要的介导作用[33]。细胞外基质累积是系统性硬化症的主要治病机制，黏着斑在细胞外基质累积过程中发挥重要作用[34]；而受KDR 介导的信号可以影响内皮细胞的迁移和增殖，进而影响病情发展[35-36]。

综上所述，当归四逆汤可以通过芍药苷、shinpterocarpin、水鬼蕉宾碱等成分作用于多靶点进而调节多条通路发挥对系统性硬化症的治疗作用。

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