HPLC 法同时测定小儿清咽颗粒中6 种成分

何 艳，胡小祥，刘洋伽，戴 瑞，唐佳齐，张 辉*

（1.湘南学院药学院，湖南 郴州 423000； 2.郴州市食品药品检验检测中心，湖南 郴州 423000）

小儿清咽颗粒收载于《中华人民共和国卫生部药品标准（中药成方制剂第六册）》，由玄参、蒲公英、牛蒡子（炒）、薄荷、蝉蜕、板蓝根、连翘、牡丹皮、青黛9 味中药组成，具有清热解表、解毒利咽功效，用于治疗外感风热引起的小儿发热头痛、咽喉肿痛、咳嗽音哑等症［1］，临床效果显著，但该制剂现行质量标准仅有牛蒡子、靛蓝的TLC 鉴别，无含量测定项，质控指标单一。目前，虽有研究针对小儿清咽颗粒中蒲公英所含绿原酸、咖啡酸，连翘所含连翘苷，玄参所含哈巴苷、哈巴俄苷，靛蓝所含靛蓝、靛玉红等单一或多种成分建立了含量测定方法［2-7］，但尚未涉及牛蒡子，并且2020 年版《中国药典》 一部蒲公英含量测定项以菊苣酸为指标成分。因此，本实验依据小儿清咽颗粒处方配伍和中药质量标志物确定原则［8］，选择君药蒲公英主要活性成分单咖啡酰酒石酸、菊苣酸［9-10］，臣药连翘主要活性成分连翘酯苷A、连翘苷［11-12］，牛蒡子（炒）主要活性成分牛蒡苷［13-14］，使药玄参主要活性成分哈巴俄苷［15-16］为研究对象，采用HPLC 法同时测定其含量，以期更全面地对该制剂质量进行控制和评价，也为相关标准提升提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪，配置G1315D 型二极管阵列检测器 （美国Agilent 公司）； XSE-205 型电子天平（0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）； DZKW-D-2 型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）； KQ-500DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 单咖啡酰酒石酸对照品（批号PRF10012701，纯度99.84%，成都普瑞法科技开发有限公司）； 连翘酯苷A、菊苣酸、连翘苷、牛蒡苷、哈巴俄苷对照品 （批号111810-201707、111752-201703、110821-202117、110819-201812、111730-201508，纯度 97.2%、96.0%、94.9%、95.0%、96.0%，中国食品药品检定研究院）。小儿清咽颗粒共12 批 （批号ZFA2006、ZBA2102、ZCA2001，A 公 司； 批 号 201004、201003、211213，B 公司； 批号220103、211201、211203，C 公司； 批号SB20017、SB20034、SB20014，D 公司，6 g／袋，有效期3 年）。色谱纯甲醇、乙腈（德国Merck 公司）； 分析纯甲酸、磷酸（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0 ～5 min，8%A； 5 ～15 min，8% ～15% A； 15 ～28 min，15% A； 28 ～40 min，15% ～25% A； 40 ～50 min，25% ～29% A； 50 ～55 min，29% ～35%A； 55～56 min，35% ～8%A； 56 ～60 min，8% A）； 体积流量1.0 mL／min； 柱温30 ℃； 检测波长330 nm （0 ～40 min，单咖啡酸酒石酸、连翘酯苷A、菊苣酸）、278 nm （40 ～60 min，连翘苷、牛蒡苷、哈巴俄苷）； 进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取单咖啡酰酒石酸、连翘酯苷A、菊苣酸、连翘苷、牛蒡苷、哈巴俄苷对照品8.18、6.99、7.26、6.30、9.21、5.02 mg，置于20 mL 量瓶中，70%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别吸取0.5、2.5、1、1.5、3、0.5 mL，置于同一10 mL 量瓶中，70%甲醇定容至刻度，即得（各成分质量浓度分别为20.42、84.93、35.43、44.84、131.2、9.638 μg／mL）。

2.2.2 供试品溶液 取装量差异项下本品，混匀，取适量至研钵中研细，精密称取1.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密量取70%甲醇25 mL，称定质量，超声（功率500 W，频率40 kHz）处理30 min，静置至室温，70%甲醇补足减失的质量，滤过，滤液过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按本品处方工艺和比例，分别制成缺玄参、缺蒲公英、缺连翘、缺牛蒡子（炒）的阴性样品，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品、对照品溶液中各成分色谱峰保留时间一致，分离度均大于1.5，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，70% 甲醇稀释至10 mL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 取对照品溶液适量，70%甲醇稀释2 倍，0.45 μm 微孔滤膜过滤，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得单咖啡酰酒石酸、连翘酯苷A、菊苣酸、连翘苷、牛蒡苷、哈巴俄苷峰面积 RSD 分别为 0.26%、0.38%、0.45%、0.62%、0.64%、0.62%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取本品（批号ZCA2001）适量，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，于0、3、6、12、18、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得单咖啡酰酒石酸、连翘酯苷A、菊苣酸、连翘苷、牛蒡苷、哈巴俄苷峰面积RSD 分别为1.75%、0.18%、1.29%、0.84%、0.76%、1.53%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 精密称取本品 （批号ZCA2001）6 份，每份约1.5 g，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得单咖啡酰酒石酸、连翘酯苷A、菊苣酸、连翘苷、牛蒡苷、哈巴俄苷含量RSD 分别为2.03%、0.64%、1.17%、0.50%、0.56%、0.79%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的本品（批号ZCA2001）6 份，每份0.75 g，置于具塞锥形瓶中，按1 ∶1 比例加入对照品溶液（0.137 6 mg／mL 咖啡酰酒石酸1 mL，0.357 3 mg／mL连翘酯苷A 2.5 mL，0.354 5 mg／mL 菊苣酸0.5 mL，0.298 7 mg／mL 连翘苷 1 mL，0.416 8 mg／mL 牛蒡苷2.5 mL，0.108 7 mg／mL 哈巴俄苷0.5 mL），70% 甲醇补足至25 mL，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，单咖啡酰酒石酸、连翘酯苷A、菊苣酸、连翘苷、牛蒡苷、哈巴俄苷平均加样回收率分别为97.63%、102.61%、96.80%、97.21%、98.27%、99.21%，RSD 分别为 1.93%、0.40%、1.11%、0.98%、0.78%、0.26%。

2.9 样品含量测定 取12 批样品，按“2.2.2”项下方法平行制备2 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果（mg／袋，n＝2）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／bag，n＝2）

3 讨论

3.1 指标成分选择 预试验分别对蒲公英、玄参、板蓝根、牡丹皮中咖啡酸、哈巴苷、（R，S）-告依春［17］、丹皮酚［18］进行考察，发现咖啡酸专属性较差，哈巴苷、（R，S）-告依春、牡丹皮含量较低，故未纳入本实验。

3.2 色谱条件选择 本实验首先采用DAD 检测器采集各成分在200 ～400 nm 波长范围内的光谱图，发现单咖啡酸酒石酸、连翘酯苷A、菊苣酸、连翘苷、牛蒡苷、哈巴俄苷最大吸收波长分别为330、328、330、278、278、280 nm，故选择278、330 nm 作为检测波长。再考察了流动相甲醇-水、乙腈-水，发现各成分色谱峰分离度、峰形较差，故分别添加不同体积分数 （0.05%、0.1%、0.15%）甲酸、磷酸，发现0.1%磷酸改善情况最好。同时，考察了不同色谱柱 ［Waters sunfire、Thermo Acclaim-C18、Agilent Zorbax-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）］对各成分色谱峰分离度的影响，发现Agilent Zorbax-C18色谱柱效果最好。

3.3 提取溶剂、方法选择 本实验首先考察了甲醇／乙醇、70% 甲醇／乙醇、50% 甲醇／乙醇，发现70%甲醇提取时各成分得率最高，色谱峰峰形最好。再分别考察了超声提取 （20、30、40、50 min）、回流提取（30、40、50、60 min）、溶剂体积（25、50 mL），发现25 mL 70% 甲醇超声提取30 min 时各成分基本提取完全。

3.4 含量分析 表3 显示，不同批次小儿清咽颗粒中连翘酯苷A、连翘苷含量波动较大，可能与连翘产地、采收时间（老翘、青翘）有关，故生产厂家需密切关注该药材质量。