小蓟TLC 鉴别方法优化及小蓟炭“炒炭存性” 内在表征研究

卢 琪，张天泽，朱娟娟，曲珍妮，徐春梦，戴衍朋*，石典花*

（1.山东省中医药研究院，山东 济南 250014； 2.国家中医药管理局中药蜜制和制炭炮制技术与原理重点研究室，山东 济南 250014； 3.北京中医药大学，北京 100105； 4.山东中医药大学，山东 济南 250014）

小蓟为菊科植物刺儿菜Cirsiumsetosum（Wild.）MB.的干燥地上部分。春、秋二季花开时采割，除去杂质，晒干，其性甘、苦、凉，归心、肝经，具有凉血止血、散瘀解毒消痈的功效，常用于治疗衄血、吐血、尿血、血淋、便血、崩漏、外伤出血、痈肿疮毒等症［1］。小蓟主要含有黄酮类、苯丙素类、木脂素类、萜类、有机酸类等成分［2-5］，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、降压、止血、凝血等作用［6-11］。临床上有生品、炒炭品两种规格的饮片，生品以凉血为主，炒炭后凉性减弱，收敛止血作用增强［12］。

目前中药的鉴别方法有很多［13-14］，TLC 鉴别为常用的理化鉴别方法，具有操作简单、成本低等特点。2005 年版《中国药典》［15］中首次收载小蓟的TLC 鉴别方法，蒙花苷为小蓟药材质量控制的指标成分［16］，至2020 年版《中国药典》 未曾改变。本研究拟对小蓟的TLC 鉴别方法进行改进，探寻采用最常规的、成本较低的硅胶G 薄层板替代聚酰胺薄膜，同时将展开剂更换为常见的试剂，降低成本和毒性。另外中药炭药炮制传统理论要求“炒炭存性”，针对“小蓟炭” 项下仅收载显微鉴别项，且目前市售小蓟炭大部分炒制过重的现状，尝试探寻并建立小蓟炭“炒炭存性” 的内在表征方法，建立能够基于内在质量变化的表征小蓟炭“炒炭存性” 的方法，可用于完善和提升小蓟和小蓟炭质控标准，保障其临床用药质量。

1 材料

1.1 仪器 XS205 10-5DU 型电子天平 （瑞士Mettler-Tolodo 公司）； DHG-9146 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）； 三频数控KQ-300VED 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； DK-S26 型数显恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）； WFH-201B 型紫外仪（上海精科实业有限公司）。

1.2 试剂与药物 蒙花苷对照品（批号111528-202112）、小蓟对照药材 （批号121436-201803）（中国食品药品检定研究院）； 金合欢素对照品（批号BP0114，成都普瑞法科技开发有限公司）。聚酰胺薄膜 （浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）； 硅胶G 板（批号20140422，青岛海洋化工厂分厂）。甲醇、乙酰丙酮、丁酮、乙醇、甲苯等均为分析纯； 水为纯净水。小蓟、小蓟炭批号及厂家见表1，经山东省中医药研究院中药资源研究所林慧彬研究员鉴定小蓟均为菊科植物刺儿菜Cirsium setosum（Wild.）MB.的干燥地上部分的切制品，小蓟炭均为小蓟的炒炭品。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 小蓟TLC 鉴别方法优化

2.1.1 2020 年版《中国药典》 收载方法 取本品粉末0.5 g，加甲醇5 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取小蓟对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。再取蒙花苷对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg 的溶液，作为对照品溶液。按2020年版《中国药典》 四部通则薄层色谱法0502，吸取上述3 种溶液各1 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酰丙酮-丁酮-乙醇-水（1 ∶3 ∶3 ∶13）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图1。由图1 可知，供试品与对照药材、对照品在相应位置上显相同颜色的荧光斑点。

图1 2020 年版《中国药典》 法小蓟TLC 色谱图Fig.1 TLC chromatograms of Cirsii Herba using the methodoftheChinesePharmacopoeia 2020 Edition

2.1.2 方法优化 取小蓟粉末1 g，加甲醇10 mL，超声处理15 min，过滤，作为供试品溶液。取小蓟对照药材，同法制成小蓟对照药材溶液。取蒙花苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。按2020 年版《中国药典》 四部通则薄层色谱法0502，吸取上述3 种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G 板上，以甲苯-丙酮-甲酸-甲醇（6 ∶3 ∶0.5 ∶2.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图2。由图2 可知，供试品与对照药材、对照品在相应位置上显相同颜色的荧光斑点。

图2 优化后的小蓟TLC 色谱图Fig.2 Optimized TLC chromatograms of Cirsii Herba

2.2 小蓟炭TLC 鉴别及应用研究 目前2020 年版《中国药典》 中关于小蓟炒炭程度是否适宜的评价仅有外观标准，未有内在评价指标，使得目前市售小蓟炭大部分炒制过重，影响临床疗效。基于此，课题组结合小蓟炭的外观性状，探寻采用TLC法建立小蓟炭“炒炭存性” 的鉴别方法。

2.2.1 小蓟炭TLC 鉴别研究 按2020 年版《中国药典》 四部0213 炮制通则炒炭要求，对小蓟炒炭时间及温度进行考察，经全国第一批老药工、知名中药炮制专家姜保生鉴定，确定炒制温度为400 ℃，炒制时间为20 min，所制得的小蓟炭外表为棕褐色，符合2020 年版《中国药典》 和传统小蓟炭炮制的外观标准。按此条件用5 批小蓟分别制备小蓟炭，并进行TLC 鉴别研究。

参照文献［17］报道，取小蓟炭粉末1 g，加甲醇10 mL，超声处理15 min，过滤，作为供试品溶液。取小蓟对照药材，同法制成小蓟对照药材溶液。取蒙花苷、金合欢素对照品适量，加甲醇制成质量浓度均为0.50 mg／mL 的溶液，作为对照品溶液。按2020 年版《中国药典》 四部通则薄层色谱法0502，吸取上述3 种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G 板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100 ∶20 ∶13）为展开剂，展至约4 cm 时，取出，晾干，继续以甲苯（水饱和）-甲酸乙酯-甲酸（4.5 ∶4.5 ∶0.5）展开，晾干，喷以三氯化铝试液，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图3。由图3可知，供试品与蒙花苷、金合欢素对照品在相应位置上显相同颜色的斑点。小蓟炒炭前后化学成分发生变化，最明显的是新产生了1 种成分，经后续进一步研究，确定其为金合欢素。

图3 小蓟炭TLC 色谱图Fig.3 TLC chromatograms of Cirsii Herba Carbonisata

2.2.2 不同炒制程度小蓟炭的识别 取小蓟饮片适量，分别在400 ℃下制备炒制10、15、20、25、30 min 的小蓟炭。根据传统外观鉴别经验认为炒制10 min 为炒轻炭，炒制15 min 为炒较轻炭，炒制20 min 为炒适中炭，炒制25 min 为炒较重炭，炒制30 min 为炒重炭，按“2.2.1” 项下方法分别制备5 个炒制时间小蓟炭供试品溶液。对照药材溶液和对照品溶液的制备及展开条件和显色条件均同“2.2.1”，结果见图4。由图4 可知，随着炒制时间的延长，蒙花苷的斑点逐渐缩小，颜色变浅，当炒制时间为30 min 时，蒙花苷斑点基本消失，此时金合欢素斑点的面积亦变小，颜色变浅。炒制时间为10、15 min 时，供试品色谱中红色的叶绿素斑点较明显，结合小蓟炭外观性状，认为当小蓟炭TLC 鉴别中能够同时识别出蒙花苷、金合欢素，且仅前沿处保留较小的叶绿素斑点时，小蓟炭的质量可达到“炒炭存性” 的标准要求，由此确定400 ℃炒制时间为20 min 的小蓟炭为最佳炒制程度的小蓟炭。

图4 不同炒炭程度小蓟TLC 色谱图Fig.4 TLC chromatograms of differently charred Cirsii Herba

2.2.3 市售小蓟炭TLC 鉴别 对市售5 批小蓟炭的炒制程度进行鉴别，供试品、对照药材溶液和对照品溶液的制备及展开条件和显色条件均同“2.2.1”，结果见图5。由图5 可知，5 批市售小蓟炭TLC 鉴别图谱存在一定的差异，其中第1、4 批蒙花苷斑点较明显，而第2、3、5 批小蓟炭蒙花苷斑点较小，颜色较浅，根据TLC 鉴别结果，可判断2、3、5 批小蓟炭炮制较重，与外观质量判断一致。

图5 市售小蓟炭TLC 色谱图Fig.5 TLC chromatograms of Cirsii Herba Carbonisata in the market

2.3 UPLC 指纹图谱 为验证“2.2.2” 项下不同炒制程度小蓟炭TLC 鉴别结果，进一步精确考察小蓟及不同炒制程度小蓟炭中蒙花苷、金合欢素的具体变化情况，对小蓟炭“炒炭存性” 的内在变化进行进一步表征，本研究采用UPLC 指纹图谱法建立小蓟炭“炒炭存性” 表征方法，并同时对蒙花苷、金合欢素的含量进行测定。

2.3.1 色谱条件 ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）； 流动相0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0 ～3.24 min，95% ～92%A； 3.24 ～15.12 min，92% ～75% A； 15.12 ～20 min，75% ～60%A； 20～25 min，60% ～20%A）；体积流量0.3 mL／min； 柱温30 ℃； 检测波长330 nm； 进样量1 μL。理论板数按蒙花苷计算不低于1 500。

2.3.2 供试品溶液制备 取小蓟和“2.2.2” 项下5 批不同炒制时间的小蓟炭粉末（过3 号筛）约0.5 g，分别精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，称定质量，回流提取30 min，放冷，再次称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.3 对照品溶液制备 取蒙花苷、金合欢素对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为0.14、0.11 mg／mL 的对照品溶液。

2.3.4 小蓟及不同炒制程度小蓟炭UPLC 指纹图谱 分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）” 进行比较，见图6。小蓟炒炭后，UPLC 指纹图谱发生明显的变化，大部分色谱峰的峰面积降低，也产生了新的色谱峰，通过归属发现，随着炒制时间的延长，蒙花苷峰面积逐渐变小，金合欢素峰面积呈现出先升高后降低的趋势。当炒制过重时，蒙花苷与金合欢素峰面积均变小，该变化趋势与“2.2.2” 项下TLC 鉴别结果一致。计算蒙花苷、金合欢素含量，见表2。400 ℃炒制15、20 min 时蒙花苷、金合欢素含量差别不大，结合外观性状及TLC 鉴别结果，进一步确定最佳条件为炒制温度400 ℃，炒制时间20 min。

图6 小蓟及其不同程度炒制品UPLC 指纹图谱Fig.6 UPLC fingerprint of Cirsii Herba and its differently charred products

表2 小蓟及其不同程度炒制品中蒙花苷、金合欢素含量（%，n＝2）Tab.2 Content of buddleoside and acacetin in Cirsii Herba and its differently charred products （%，n＝2）

3 讨论

本研究将小蓟的TLC 鉴别方法中的聚酰胺薄膜改成硅胶G 板，将展开剂从乙酰丙酮-丁酮-乙醇-水（1 ∶3 ∶3 ∶13）改为甲苯-丙酮-甲酸-甲醇（6 ∶3 ∶0.5 ∶2.5），改进的小蓟TLC 鉴别方法具有操作简单，蒙花苷斑点清晰，重复性好，有效节约成本，减少有毒试剂使用等众多优点。改进的TLC 鉴别方法经方法学验证和多次重复实验验证，展开效果好，分离度高。

小蓟在炒炭的过程中，受加热温度和时间的影响，其中的黄酮类成分会发生变化［18-19］。本研究发现，小蓟炒炭后新产生了1 种成分，根据黄酮类成分蒙花苷在炒炭过程中减少的现象，初步推测其可能为蒙花苷加热后新产生的成分，对该成分分离后，采用UPLC 法和液-质联用综合确认为蒙花苷的苷元——金合欢素。因此金合欢素可用于有效识别小蓟和小蓟炭，作为提升小蓟炭质控标准的指标。基于此采用二次展开的方法建立了小蓟炭TLC鉴别方法，该TLC 鉴别方法经方法学验证，证明展开效果较好。后采用该方法对不同炒制程度的小蓟炭进行鉴别，结果发现随着炒制时间的延长，蒙花苷斑点逐渐减少并消失殆尽，炒制过重时金合欢素亦消失。进一步采用UPLC 法建立了小蓟及其不同程度炒制品UPLC 指纹图谱，同时对其蒙花苷和金合欢素的含量进行测定，发现蒙花苷与金合欢素的含量变化与TLC 鉴别结果一致。基于上述变化建立了采用TLC、UPLC 指纹图谱判断小蓟炭“炒炭存性” 的内在表征研究方法，该方法可用于鉴别小蓟炭的炮制程度，有效提升因个体主观差异，使得对小蓟炭外观质量判断标准不一的现状。综上所述，本研究初步建立了小蓟炭“炒炭存性” 的内在质量鉴别标准，并从定量上进行了验证，下一步将健全小蓟炭“炒炭存性” 的质量标准，深度解析小蓟炭“炒炭存性” 的科学内涵，有效保障小蓟炭临床用药质量。