千里光化学成分及其心肌细胞保护活性

刘 平，吴 凯，赵生文

（1.海南省司法医院，海南 海口 571100； 2.广西中医药大学，广西 南宁 530000； 3.海南医学院第一附属医院，海南 海口 570102）

千里光属植物目前有一千余种，主要分布在除南极洲之外的全球各地，其中我国有63 种，主要分布在西南地区，包括千里光、欧洲千里光、北千里光等［1-2］。该属植物具有丰富的化学结构类型，包括倍半萜、二萜、生物碱、黄酮、挥发油等［3-6］，其中吡咯里西啶型生物碱是该属植物造成肝肾毒性的主要毒性成分［7］。现代药理学研究发现，千里光属植物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、保肝、舒缓平滑肌、抗氧化等活性［8-10］。

千里光为菊科千里光属多年生草本植物千里光SenecioscandensBuch.-Ham.的干燥地上部分，味苦，性寒，归肺、肝经，具有清热解毒、明目、利湿的功效，用于痈肿疮毒、感冒发热、目赤肿痛、泄泻痢疾、皮肤湿疹等疾病的治疗［11］，倍半萜类成分是该植物的代表性药效成分［12-13］。为进一步寻找倍半萜类成分，丰富该属植物的化学结构类型，本实验围绕千里光进行化学成分研究。综合运用各种色谱学和波谱学方法，从中分离得到7 个倍半萜类单体化合物，其中化合物1 为新化合物，其他化合物均首次从该植物中分离，同时体外细胞实验发现，化合物2～3、5 具有良好的心肌细胞保护活性。

1 材料

Bruker Avance-400 型核磁共振光谱仪（德国Bruker 公司）； SAD-M20A、LC-60AD 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）； Hpf-1722 型分析天平（美国Ohaus 公司）； RE2000A 型旋转蒸发仪（河南巩义予华仪器有限公司）； 色谱柱（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC 公司）； MCI gel CHP 20P（75～150 μm，日本三菱公司）； Sephadex LH-20 凝胶（美国GE 公司）； ODS （ODS-A 12 nm S-50 μm，日本YMC 公司）； 硅胶（100 ～200、200 ～300 目，青岛海洋化工有限公司）。氘代氯仿（0.1% TMS，宁波萃英化学技术有限公司）； 其余试剂均为分析纯或色谱纯。

H9c2 细胞株（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）； DMEM 培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素（PS）、胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；96 孔板、MTT （上海碧云天生物技术有限公司）； 槲皮苷、过氧化氢（上海源叶生物科技有限公司）。

千里光于2021 年6 月购自安徽亳州中药材市场，经广西中医药大学吴凯鉴定为菊科千里光属植物千里光SenecioscandensBuch.-Ham.ex D.Don 的干燥地上部分。

2 提取与分离

15.2 kg 千里光粉碎，95% 乙醇冷浸提取，减压浓缩，得到浸膏1.5 kg，用2 L 水均匀混悬后依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，减压浓缩，得到石油醚部位300 g，经100 ～200 目硅胶柱分离，以石油醚-丙酮（100 ∶0 ～0 ∶100）梯度洗脱，TLC 检识合并，得到Fr.A～Fr.J。

Fr.D （25.7 g）经MCI 柱分离，以75% ～100%乙醇梯度洗脱，得到Fr.D1 ～Fr.D4。Fr.D2（5.2 g）经200 ～300 目硅胶柱分离，以石油醚-乙酸乙酯（100 ∶0～0 ∶100）梯度洗脱，TLC 检识合并，得到Fr.D2-1～Fr.D2-7。Fr.D2-4 有晶体析出，以二氯甲烷-甲醇-水（1 ∶1 ∶0.1）重结晶，得到化合物4 （100 mg）。Fr.D2-5 （1.5 g）经反相硅胶柱分离，以70% ～100% 甲醇梯度洗脱，得到Fr.D2-5-1～Fr.D2-5-5。Fr.D2-5-3 （720 mg）经反相硅胶柱分离，以60% ～100%丙酮梯度洗脱，得到Fr.D2-5-3-1 ～Fr.D2-5-3-3。Fr.D2-5-3-1 （110 mg）经半制备HPLC 纯化，以70% 甲醇洗脱，得到化合物1 （tR＝23.4 min，2.4 mg）、2 （tR＝27.9 min，4.9 mg）。Fr.D2-5-3-2 （327 mg）经半制备HPLC 纯化，以60%乙腈洗脱，得到化合物3 （tR＝42.1 min，13.9 mg）、5 （tR＝44.7 min，5.4 mg）。Fr.D2-6 （2.7 g）经Sephadex LH-20 分离，以二氯甲烷-甲醇（1 ∶1）洗脱，得到Fr.D2-6-1～D2-6-6。Fr.D2-6-3 （1.1 g）经硅胶柱分离，得到化合物6（76.5 mg）和Fr.D2-6-3-1～Fr.D2-6-3-4。Fr.D2-6-3-2 （115 mg）经半制备HPLC 纯化，以72%甲醇洗脱，得到化合物7 （tR＝35.5 min，12.7 mg）。

3 结构鉴定

图1 化合物1 的结构和关键HMBC、1H-1H COSY 相关Fig.1 Structure and key HMBC，1H-1H COSY correlations on compound 1

1H-NMR 显示化合物1 在低场区存在2 个存在间位耦合的芳环质子δH7.20 （1H，d，J＝1.20 Hz，H-6），7.11 （1H，d，J＝1.20 Hz，H-8）。此外，观察到存在1 个次甲基信号和3 组亚甲基信号δH2.93 （1H，m，H-4），2.60 （2H，m，H-1），1.88 （1H，m，H-2a），1.77 （1H，m，H-2b），1.59 （2H，m，H-3），4 组甲基信号δH2.33（3H，s，11-CH3），1.58 （6H，s，13，14-CH3），1.30 （3H，s，15-CH3）。13C-NMR 结合DEPT135谱提示化合物1 存在15 个碳原子，包括1 组芳环信号δC146.1 （C-7），142.2 （C-5），136.4 （C-9），133.9 （C-10），123.4 （C-8），122.0 （C-6），1 个连氧季碳信号δC75.6 （C-12），1 个次甲基信号δC33.2 （C-4），3 个亚甲基信号δC31.0 （C-3），27.0 （C-1），20.1 （C-2），4 个甲基信号δC31.9 （C-13 ～14），23.3 （C-15），20.1 （C-11）。以上数据提示化合物1 为倍半萜类化合物，经检索［14］化合物 1 与 1，2，3，4-tetrahydro-1，5-dimethyl-7-isopropylnaphthalene 存在相同的化学骨架，仔细比对提示其可能是该化合物的C-12 位羟基氧化衍生物。

HSQC 图谱对化合物1 的碳氢数据进行的完全归属，1H-1H COSY 图谱提示存在2.60 （H-1）↔1.88 （H-2a）／1.77 （H-2b）↔1.59 （H-3）的一组自旋耦合系统。在HMBC 谱中可以观察到13-CH3、14-CH3与C-7、C-12 之间，H-6、H-8 与C-7、C-12 之间存在远程相关关系，即化合物1 是1，2，3，4-tetrahydro-1，5-dimethyl-7-isopropylnaphthalene的氧化衍生物。由此化合物1 的平面结构确定，进一步分析发现其中还存在1 个手性中心，通过与已知化合 物 6，9-dihydroxy-1-oxo-14-noreudesm-5，7，9-triene［15］比对比旋光值可以确定化合物1 的构型为R型。至此确认化合物1 为新的倍半萜类化合物，命名为（R）-千里光萜醇。详见表1。

表1 化合物1 的1H-NMR 和13C-NMR 数据Tab.1 1H-NMR and13C-NMR spectra data on compound 1

化合物2：淡黄色油状液体，分子式C15H22O3，ESI-MSm／z：251.1 ［M＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ：3.04 （1H，d，J＝11.54 Hz，H-9a），3.03 （1H，dd，J＝9.59，5.39 Hz，H-1），2.96（1H，d，J＝10.34 Hz，H-5），2.67 （1H，dd，J＝10.76，3.96 Hz，H-6a），2.65 （1H，d，J＝10.28 Hz，H-9b），2.28 （1H，m，H-6b），2.21（1H，dd，J＝14.53，10.86 Hz，H-2a），2.13（1H，dd，J＝13.09，7.69 Hz，H-3a），1.76（3H，d，J＝6.12 Hz，12-CH3），1.75 （3H，d，J＝6.12 Hz，13-CH3），1.44 （1H，dt，J＝14.42，9.16 Hz，H-2b），1.36 （3H，s，14-CH3），1.33（3H，s，15-CH3），1.09 （1H，td，J＝12.58，8.17 Hz，H-3b）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：207.4 （ C-8），135.7 （ C-11），134.3 （ C-7），62.3 （5），60.0 （C-1），59.4 （C-4），57.4 （C-10），56.3 （C-9），34.1 （C-3），30.1 （C-6），24.4 （C-2），23.1 （C-12），21.4 （C-13），16.2（C-15），16.1 （C-6）。以上数据与文献［16］报道基本一致，故鉴定为（1S，10S），（4S，5S）-germacrone-1 （10），4-diepoxide。

化合物3：无色油状液体，分子式C15H22O2，ESI-MSm／z：235.2 ［M＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ：5.76 （1H，s，H-3），5.05 （1H，d，J＝1.65 Hz，H-12），4.90 （1H，d，J＝1.68 Hz，H-12），4.09 （2H，m，H-13），2.53 （1H，m，H-5），2.20 （1H，m，H-1），2.11 （1H，m，H-1），1.90 （3H，s，14-CH3），1.55 （1H，m，H-8），1.48 （1H，m，H-9），0.88 （3H，s，15-CH3）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：55.0 （C-1），198.2 （C-2），127.1 （C-3），163.0 （C-4），48.9 （C-5），30.4 （C-6），42.5 （C-7），27.8（C-8），41.0 （C-9），38.2 （C-10），155.3 （C-11），107.9 （C-12），65.0 （C-13），21.9 （C-14），17.1 （C-15）。以上数据与文献［17］报道基本一致，故鉴定为12-羟基-莎草酮。

化合物4：无色油状液体，分子式C15H22O2，ESI-MSm／z：235.1 ［M＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ：2.74 （2H，brs，H-7），2.47 （2H，d，J＝15.47 Hz，H-10），2.40 （2H，t，J＝7.52 Hz，H-4），2.08 （3H，s，15-CH3），2.02 （3H，s，12-CH3），1.73 （3H，s，13-CH3），1.52 （2H，m，H-3），1.05 （3H，s，14-CH3），0.61 （1H，m，H-6），0.38 （1H，m，H-2）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：208.6 （C-4），201.6 （C-8），147.3 （C-11），128.1 （C-7），48.9 （C-9），43.9（C-3），30.0 （C-15），28.0 （C-6），24.2 （C-1），24.1 （C-5），23.4 （C-2），23.4 （C-12），23.4（C-13），20.1 （C-10），19.1 （C-14）。以上数据与文献 ［18］报道基本一致，故鉴定为urcumenone。

化合物5：黄色油状液体，分子式C15H24O2，ESI-MSm／z：237.3 ［M＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ：5.77 （1H，s，H-1），2.40 （2H，m，H-9），2.33 （2H，m，H-4），2.12 （3H，s，14-CH3），1.93 （1H，dd，J＝13.22，6.56 Hz，H-5a），1.74 （1H，dd，J＝13.41，5.94 Hz，H-5b），1.52 （3H，m，H-8，7a），1.38 （1H，m，H-7b），1.10 （6H，d，J＝6.86 Hz，11，12-CH3），1.06 （3H，s，15-CH3）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：204.6 （C-1），169.7 （C-3），122.4 （C-2），44.2 （C-9），43.8 （C-6），36.2（C-7），35.5 （C-13），33.4 （C-5），30.0 （C-10），24.8 （C-4），22.1 （C-6），20.9 （C-11），20.8 （C-12），18.5 （C-8）。以上数据与文献［19］报道基本一致，故鉴定为isopterchiayione。

化合物6：黄色油状液体，分子式C15H22O2，ESI-MSm／z：235.1 ［M＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ：5.49 （1H，m，H-5），3.05 （1H，dd，J＝16.75，7.32 Hz，H-6a），2.95 （1H，m，H-6b），2.91 （2H，dd，J＝13.59，4.24 Hz，H-9），2.57 （1H，m，H-10），2.50 （1H，m，H-3a），2.43 （1H，m，H-3b），2.22 （2H，m，H-2），2.12 （3H，s，14-CH3），1.97 （3H，s，13-CH3），1.77 （3H，s，12-CH3），1.04 （3H，d，J＝7.07 Hz，H-15）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：208.4 （C-4），205.3 （C-8），143.9 （C-1），140.8 （ C-11），134.8 （ C-7），121.3 （ C-5），48.7 （C-9），42.8 （C-3），35.2 （C-10），30.4（C-14），30.1 （C-2），28.0 （C-6），22.7 （C-12），22.4 （C-13），19.3 （C-15）。以上数据与文献［20］报道基本一致，故鉴定为curcumadione。

化合物7：无色油状液体，分子式C15H24O2，ESI-MSm／z：237.1 ［M＋H］＋。1H-NMR （400 MHz，CDCl3）δ：5.90 （1H，s，H-6），2.83 （1H，m，H-1），2.51 （1H，m，H-3a），2.37 （1H，m，H-3b），2.33 （2H，m，H-2a，8a），2.20 （1H，m，H-11），2.18 （1H，m，H-8b），2.11 （3H，s，15-CH3），2.00 （2H，m，H-9a，10），1.60 （1H，m，H-2b），1.10 （1H，m，H-9b），1.07 （3H，d，J＝6.58 Hz，13-CH3），1.06 （3H，d，J＝6.62 Hz，12-CH3），0.80 （3H，d，J＝6.64 Hz，14-CH3）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：208.9 （C-4），203.4 （C-5），170.2 （C-7），128.0 （C-6），52.9 （C-1），42.0 （C-3），38.1 （C-11），36.3（C-9），33.7 （C-10），29.9 （C-15，8），22.4（C-2），21.0 （C-13），20.7 （C-12），16.3 （C-14）。以上数据与文献［21］报道基本一致，故鉴定为gibberodione。

4 心肌细胞保护活性研究

参考文献［22］报道，将H9c2 细胞细胞常规培养于含10% 胎牛血清的DMEM 培养基中，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。细胞生长至对数期后，PBS 缓冲溶液冲洗细胞2 次，用0.25%胰酶消化，制成细胞密度为3×103／孔的单细胞悬液，接种于96 孔板，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养16 h，弃去上清，将细胞分为空白组、模型组（H2O2组）、给药组、阳性对照组，每组6 个复孔。空白组加入100 μL 完全培养基，模型组加入含200 μmol／L H2O2的完全培养基100 μL，给药组分别加入100 μL 含200 μmol／L H2O2和50 μmol／L化合物1 ～7，阳性对照组加入50 μmol／L 槲皮苷，培养24 h。每孔加入MTT 溶液使其终浓度为500 μg／mL，培养4 h，吸去上清液，每孔加入100 μL DMSO，避光溶解10 min，于570 nm 波长处测定吸光度值。通过GraphPad 8.0 软件进行处理，数据以（±s）表示，组间两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

结果表明，化合物2～3、5 的细胞存活率分别为（75.2 ± 0.54）%、（66.4 ± 0.79）%、（59.7 ±0.91）%，槲皮苷细胞存活率为（74.9±0.47）%，具有较好的心肌细胞保护活性。

5 讨论

本实验以千里光入手，从其石油醚部位分离鉴定了7 个单体化合物，经鉴定所有化合物均为倍半萜类，其中化合物1 为新化合物，化合物2 ～7 均为首次在该药材中分离得到，体外细胞学实验表明，化合物2 ～3、5 具有良好的心肌细胞保护活性，是潜在的心肌保护药物研发的先导化合物。以上实验结果，进一步拓宽了千里光的研究范围，为其综合开发利用提供了新的思路和方向。