益肾软坚散对功能性失调子宫出血小鼠子宫内膜血管重塑的影响

杨冰琦，高丽敏，李永章，刘 霞

（1.河北省中医院导管室，河北 石家庄 050011； 2.河北省中医院泌尿外科，河北 石家庄 050011；3.河北省中医院妇产科，河北 石家庄 050011）

功能性失调子宫出血 （dysfunctional uterine bleeding，DUB）简称功血，是一种妇科常见的症状和体征［1］，其发病率约11% ～13%［2］。DUB 是由于下丘脑-垂体-卵巢轴调节异常使神经内分泌系统功能紊乱从而导致的非正常性子宫出血［3］。DUB患者的临床表现为月经周期延长，经量异常等，有时甚至出现阴道持续出血的现象［4-5］。DUB 降低女性的生活质量，并给患者带来了沉重的医疗负担。目前DUB 的发病机制还未清晰，而子宫内膜腺上皮和血管的再生是子宫内膜修复和脱落的主要机制［6］，但目前国内外关于改善DUB 子宫内膜血管重塑的分子机制研究鲜有报道。

中医认为，肾虚血瘀、脾虚、血不归经等是导致功能失调性子宫出血的主要诱因［7］，而活血化瘀软坚散的多种有效成分已被证实具有健脾补肾、活血化瘀之效［8］，益肾软坚散在临床上对于治疗DUB 有一定疗效，但其研究还不是很深入，且分子机制尚不清楚。因此，本研究拟验证益肾软坚散对DUB 小鼠子宫内膜形态学变化及细胞凋亡，生殖内分泌激素水平的调节作用及其使子宫内膜血管重塑相关分子机制，以期为治疗DUB 提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与药物 参照张聪等［9］方法制备益肾软坚散水煎剂，将丹参、炙鳖甲、生黄芪、全当归、虫草菌丝等8 味中药药材（北京同仁堂石家庄店，经河北省中医院主任中药师相聪坤鉴定为正品）常规水煎，浓缩为生药量2 g／mL 的水煎剂。宫血宁胶囊（云南白药集团股份有限公司，国药准字Z20020087，规格0.13 g×18 粒）； 米非司酮、米索前列醇 （华润紫竹药业有限公司，国药准字H20010633、H20000668，规格10 mg×2 s、0.2 mg×3 s）。TUNEL 凋亡试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号KGA7071）； 一氧化氮（NO）、血管紧张素（Ang Ⅱ）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司，货号A012-1-2、H185、H101-1-2、H206-1-2、H102-1、H089）； 免疫组化SP 法试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号SPN-9002）； DAB 显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司，批号DAB-0031／1031）； 肌动蛋白（β-actin）、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、基质金属蛋白酶-9 （MMP-9）、转化生长因子-β（TGF-β）抗体（美国Cell Signaling Technology 公司，货号4970、65373、98658、3852、3711）。

1.2 动物 46 只成熟未生育的C57BL／6 雌性小鼠，23 只C57BL／6 雄性小鼠，体质量18 ～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （京）2019-0009］，独立饲养在河北医科大学 ［实验动物使用许可证号SYXK （冀）2020-002］，环境温度20 ～25 ℃，相对湿度（50±5）%。动物实验已获得河北医科大学实验动物福利伦理委员会批准（伦理号IACUCHebmu-2021042），并尽最大努力减少动物痛苦，减少实验中的动物数量。

1.3 仪器 高速低温离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号H2050R）； 垂直电泳槽、电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司，型号JY-SCZ4＋、JY200C）；、水平脱色摇床（江苏科析仪器有限公司，型号TY-80A）； 化学发光凝胶成像仪（上海天能科技有限公司，型号5200）； 高速低温组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司，型号KZ-III-F）； 超低温冰箱（海尔集团公司，型号DW-86L386）； 全功能酶标仪 MK3 （美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.4 分组、造模及给药 参照吕小波等［10］方法，按照雌性小鼠与雄性小鼠2 ∶1 的比例合笼，次日8：00 检查阴栓与阴道涂片，以发现精子为妊娠第1 天。随机选择32 只妊娠小鼠分为对照组、模型组、益肾软坚散组和宫血宁胶囊组，每组8 只。造模组小鼠在妊娠第7 天8：00 灌胃米非司酮（8.3 mg／kg），18：00 灌胃米索前列醇（100 μg／kg），将棉球（60 ～65 mg）填入阴道内，次日检查棉球有血渍表示建模成功，对照组灌胃等量生理盐水。造模成功后第1 天，对照组和模型组灌胃生理盐水，宫血宁胶囊组灌胃0.07 g／kg 宫血宁胶囊溶液，益肾软坚散组参照文献［9］报道换算成小鼠用量，灌胃28.9 g／kg 益肾软坚散水煎剂，每天1次，连续给药7 d。

1.5 HE 染色观察子宫内膜组织形态学 妊娠第14 天，小鼠脱颈处死后，采集子宫内膜组织，固定于4%中性甲醛溶液中，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制备石蜡切片（4 μm），苏木精与伊红染色，于显微镜下观察子宫内膜组织形态学变化及子宫内膜厚度变化，拍照并保存。

1.6 ELISA 法检测血清FSH、LH、E2、P 水平和子宫内膜组织Ang Ⅱ、NO 活性 妊娠第14 天，小鼠脱颈处死后采集腹主动脉血液2 mL，2 000 r／min离心15 min，分离得血清，采用试剂盒检测血清FSH、LH、E2、P 水平。采集子宫内膜组织后按照试剂盒说明书检测Ang Ⅱ、NO 活性。

1.7 TUNEL 法检测子宫内膜组织凋亡情况 取子宫内膜组织石蜡切片，置于染色缸中，用二甲苯浸洗2 次，每次5 min，使用TUENL 试剂盒染色，滴加50 μL TDT 酶反应液（置于冰上），于湿盒内37 ℃避光反应60 min，PBS 漂洗3 次，滴加50 μL Streptavidin-HRP 工作液，于湿盒内37 ℃避光反应30 min，PBS 漂洗3 次，每次5 min，滴加50 ～100 μL DAB 显色10 min，PBS 漂洗3 次，苏木素复染细胞核，流水冲洗，脱水后加抗荧光衰减封片液封片，荧光显微镜进行图像采集。

1.8 免疫组化法检测子宫内膜组织α-SMA 蛋白表达 取子宫内膜组织，按EnVision 试剂盒说明书对子宫内膜微血管内皮细胞进行α-SMA 免疫组化染色。首先在低倍镜下（×200）全面观察切片，找出高血管密度区，然后在高倍视野下（×400）记录5 个视野的微血管数，取平均值。α-SMA 以细胞膜棕黄色为阳性，并测定各组平均光密度值作为阳性率。

1.9 Western blot 法检测子宫内膜组织VEGF、bFGF、MMP-9、TGF-β 蛋白表达 取子宫内膜组织，提取蛋白，将蛋白质样品经SDS-PAGE 凝胶电泳分离，转移到PVDF 膜后，于5% 封闭液中（TBST 配制）封闭2 h，加入VEGF、bFGF、MMP-9、TGF-β、β-actin 抗体，4 ℃孵育过夜，次日加入用5% BSA 配制的相应二抗，室温摇床孵育1.5 h，TBST 洗膜3 次后进行化学发光法显影，采用Image J 软件对图像进行定量分析。

1.10 统计学分析 通过SPSS 20.0 软件进行处理，计量资料以（±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，组间均数比较采用最小差数（LSD）法。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 益肾软坚散对DUB 小鼠子宫内膜形态学变化的影响 如图1 所示，与对照组比较，模型组小鼠子宫内膜上皮细胞增生，呈多层排列，较紊乱，部分上皮细胞变性坏死，见胞核固缩、崩解，胞质溶解，子宫组织内膜层变薄（P＜0.01），子宫内膜固有层基质细胞排列较紧密，基质细胞增生，较多炎性细胞浸润，见中性粒细胞、浆细胞和淋巴细胞，提示造模后子宫内膜形态学变化为不同细胞数量增多，且伴有炎症和坏死； 与模型组比较，益肾软坚散组和宫血宁胶囊组子宫组织内膜、肌层和外膜结构清晰，子宫内膜上皮细胞排列较规则，子宫内膜固有层基质细胞增生，少量炎性细胞浸润，主要见中性粒细胞，子宫腺结构正常，腺上皮细胞排列整齐，子宫组织内膜层变厚（P＜0.01），未见扩张，表明益肾软坚散和宫血宁胶囊处理后子宫内膜的异常形态学变化得到改善。

图1 益肾软坚散对DUB 小鼠子宫内膜形态学变化的影响（x±s，n＝5）Fig.1 Effects of Yishen Ruanjian Powder on morphological changes of endometrium in DUB mice （x±s，n＝5）

2.2 益肾软坚散对DUB 小鼠血清激素水平的影响 如图2 所示，与对照组比较，模型组小鼠血清FSH、E2、P 水平升高（P＜0.01），LH 水平降低（P＜0.01）； 与模型组比较，益肾软坚散组和宫血宁胶囊组小鼠血清FSH、E2、P 水平降低 （P＜0.05，P＜0.01），LH 水平升高（P＜0.05）。

图2 益肾软坚散对DUB 小鼠血清激素水平的影响（±s，n＝10）Fig.2 Effects of Yishen Ruanjian Powder on serum hormone level in DUB mice （±s，n＝10）

2.3 益肾软坚散对DUB 小鼠子宫内膜组织凋亡的影响 如图3 所示，与对照组比较，模型组小鼠子宫内膜组织细胞凋亡率升高（P＜0.01）； 与模型组比较，益肾软坚散组和宫血宁胶囊组小鼠子宫内膜组织细胞凋亡率降低（P＜0.01）。

图3 益肾软坚散对DUB 小鼠子宫内膜组织凋亡的影响（×400，x±s，n＝5）Fig.3 Effects of Yishen Ruanjian Powder on endometrial apoptosis in DUB mice （×400，x±s，n＝5）

2.4 益肾软坚散对DUB 小鼠子宫内膜血管重塑障碍的影响

2.4.1 益肾软坚散对DUB 小鼠子宫内膜组织α-SMA 蛋白表达的影响 如图4 所示，与对照组比较，模型组小鼠子宫内膜组织α-SMA 蛋白表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，益肾软坚散组和宫血宁胶囊组小鼠子宫内膜组织α-SMA 蛋白表达升高（P＜0.01）。

图4 益肾软坚散对DUB 小鼠子宫内膜组织α-SMA 蛋白表达的影响（x±s，n＝5）Fig.4 Effects of Yishen Ruanjian Powder on endometrial α-SMA protein expression of DUB mice （x±s，n＝5）

2.4.2 益肾软坚散对DUB 小鼠子宫内膜组织AngⅡ和NO 活性的影响 如图5 所示，与对照组比较，模型组小鼠子宫内膜内组织Ang Ⅱ活性升高（P＜0.01），NO 活性降低（P＜0.01）； 与模型组比较，益肾软坚散组和宫血宁胶囊组小鼠子宫内膜内组织Ang Ⅱ活性降低（P＜0.05，P＜0.01），NO 活性升高（P＜0.05，P＜0.01）。

图5 益肾软坚散对DUB 小鼠子宫内膜组织Ang Ⅱ和NO 活性的影响（x±s，n＝5）Fig.5 Effects of Yishen Ruanjian Powder on endometrial Ang Ⅱand NO activities of DUB mice （x±s，n＝5）

2.4.3 益肾软坚散对DUB 小鼠子宫内膜组织bFGF、MMP-9、TGF-β、VEGF 蛋白表达的影响如图6 所示，与对照组比较，模型组小鼠子宫内膜组织bFGF、MMP-9、TGF-β 蛋白表达升高 （P＜0.01），VEGF 蛋白表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，益肾软坚散组和宫血宁胶囊组小鼠子宫内膜组织bFGF、MMP-9、TGF-β 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），VEGF 蛋白表达升高（P＜0.05）。

图6 益肾软坚散对DUB 小鼠子宫内膜组织bFGF、MMP-9、TGF-β、VEGF 蛋白表达的影响（±s，n＝5）Fig.6 Effects of Yishen Ruanjian Powder on endometrial protein expressions of bFGF，MMP-9，TGF-β and VEGF of DUB mice （±s，n＝5）

3 讨论

中医学认为功血属于“崩漏” 范畴，该病是由于脾气虚弱、统摄无力、冲任失固、不能摄血从而导致的，如果崩漏日久，耗伤气血，气虚运血无力，气虚血瘀致血不归经，会进一步加重崩漏症状［11］。研究表明益肾软坚散具有活血化瘀的功效，其主要成分菟丝子、夏枯草等对心血管循环系统发挥保护作用［12-13］，提示益肾软坚散可能对改善血管重塑有促进作用。临床研究表明益肾软坚散对于治疗子宫内膜囊腺型增生性功血有效果［14］。

功血的发病机制目前尚不清楚，现阶段主要认为功血是由患者子宫内膜局部微环境改变及神经内分泌异常所致［15］。子宫局部微环境包括血管活性物质、生长因子、细胞外基质等，其中血管活性物质包括Ang Ⅱ、NO 等，生长因子包括VEGF、bFGF、MMP-9、TGF-β 等。研究表明Ang Ⅱ可诱导小鼠血管重塑，恢复弹性蛋白的表达［16］； miR-214 在血管平滑肌细胞（VSMCs）中建立了Ang Ⅱ诱导的AT1R 信号与TGF-β 诱导的TβRI／Smad 信号之间的串扰，从而在血管重塑中发挥着关键作用［17］； VEGF 可以诱导分泌和血管重构，促进血管生成［18］； MMP-9 在血管炎症反应中表达上调，参与血管重构过程［19］； bFGF 和VEGF 的表达升高时会减轻炎症反应，增加细胞增殖和血管生成［20］。当血管活性物质、生长因子及细胞外基质异常时会使血管扩张从而引起子宫局部微环境的改变导致子宫内膜出血［21］。神经内分泌异常会导致内分泌激素含量失衡从而引起功血，内分泌激素包括FSH、LH、E2、P 等。研究表明机体下丘脑-腺垂体-卵巢轴的持续反馈环节异常，会引起黄体生成素、卵泡刺激素、孕激素及雌激素含量比例异常进而引起功血［22］。

本研究发现，模型组小鼠子宫内膜上皮细胞紊乱排列，细胞外基质中较多炎性细胞分布，子宫内膜厚度变薄，Ang Ⅱ、NO 活性及VEGF、bFGF、MMP-9、TGF-β、α-SMA 蛋白表达异常，FSH、LH、E2、P 激素水平失衡，提示造模成功。而当给予益肾软坚散干预后，子宫内膜上皮细胞排列变规则，炎性细胞变少，子宫内膜厚度变厚，血管活性物质Ang Ⅱ、NO 活性及FSH、LH 等内分泌激素水平及血管相关生长因子的表达趋于正常，表明益肾软坚散对功血引起的小鼠子宫内膜形态学异常、子宫内膜血管重塑障碍及内分泌激素水平失调具有改善作用。另外，益肾软坚散干预后DUB 小鼠子宫内膜组织细胞凋亡率降低，提示益肾软坚散可以改善DUB 小鼠子宫内膜细胞凋亡情况。

综上所述，益肾软坚散可以改善DUB 小鼠子宫内膜形态学异常、子宫内膜血管重塑障碍及细胞凋亡现象，并可能通过下丘脑-腺垂体-卵巢轴调节生殖内分泌激素水平进而促进卵泡成熟及排卵。